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RIP3(receptor-interacting serine/threonine protein kinases 3)是苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶家族成员之一,除了RIP激酶家族特有的RIP激酶结构域外,RIP3还有一个独特的C端caspase激活和募集结构域。此结构域可以和RIP激酶另一家族成员RIP1结合进而诱导细胞发生程序性坏死。程序性坏死以前被认为是凋亡被抑制情况下细胞死亡的一种交替过程。目前,程序性坏死被认为在调节各种生理过程中起着举足轻重的作用。值得注意的是,它介导了多种人类疾病,如缺血性脑损伤、免疫系统紊乱和癌症。急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种以未成熟克隆性髓系细胞增殖和异常分化为特征的异质性血液系统恶性肿瘤。目前临床上主要是通过化疗药治疗白血病,AML预后不良,特别是在老年人中,主要与白血病复发和初次治疗无反应有关。在许多白血病案例中,一些细胞会在化疗药中存活、扩增进而爆发,它的长期存活率很低,复发率很高,而且在复发率很高的情况下,通常对现有的治疗方法有抗药性,抗药性仍然是一个很严重的问题。细胞凋亡信号通路调控在克服白血病干细胞耐药中发挥着重要的作用。随着对白血病耐药机制研究的不断深入,自噬被发现在白血病对化疗药的耐药中亦发挥着至关重要的作用。目的:基于此,本课题以MLL-AF9 AML细胞为研究对象,研究内容主要包括两部分:1、探讨RIP3缺失是否可以影响MLL-AF9 AML细胞对化疗药DNR敏感性;2、探究RIP3缺失在MLL-AF9 AML细胞面对血清饥饿应激时对生长发育的调节作用。方法:1、通过MTT比色法和流式细胞术检测化疗药柔红霉素处理或未加化疗药48 h后或在血清饥饿应激12 h后RIP3缺失对细胞增殖、细胞周期和细胞分化的影响。2、Annexin V/PI染色和western-blot检测疗药柔红霉素处理或未加化疗药48 h后或在血清饥饿刺激12 h后细胞的凋亡、LC3和Bcl-2蛋白的表达水平。3、通过Giemsa染色和免疫荧光染色观察细胞形态变化和LC3蛋白的表达与定位。4、通过qRT-PCR检测与白血病预后不良相关基因的表达。结果:1、不同浓度的DNR处理细胞48 h后,MTT结果显示随着DNR浓度的增加细胞的死亡率也呈现浓度依赖性,但是RIP3缺失组细胞相对于WT细胞对DNR的敏感性较低,GSK’872处理细胞后与WT细胞无明显差异。2、10nM的DNR处理细胞24 h后,细胞大部分被阻滞于S/G2期,而RIP3缺失细胞的凋亡水平降低,同时LC3和Bcl-2表达水平也上调,相关基因的表达降低。3、在血清饥饿刺激12 h后,RIP3缺失组细胞相比于WT组,细胞的增殖速度加快,细胞膜结构完整,同时胞质出现类似于自噬泡结构,CD117阳性细胞百分比和Annexin V~+PI~-细胞百分比明显降低,而且LC3蛋白表达也明显增加。结论:1、敲除RIP3可能通过引发存活信号通路的激活,促进白血病细胞的增殖,进而导致白血病细胞对柔红霉素的敏感性降低,并与其细胞周期无关。2、RIP3缺失能够调节MLL-AF9白血病细胞对血清饥饿的应激反应。3、本研究结果表明,RIP3缺失激活重要信号分子Bcl-2、LC3介导细胞增殖、凋亡和自噬机制,参与白血病细胞的保护作用,可能是AML细胞对DNR耐药的重要分子机制,而这种耐药的具体机制亟需进一步探索。