甘露聚糖酶在寡糖的制备、啤酒的澄清及咖啡提取物的浓缩等食品加工过程中存在着巨大的应用潜力。但是，由于其热稳定性差，在实际生产应用中受到了限制。本研究首先将嗜热甘露聚糖酶BK01野生型基因进行密码子优化并在毕赤酵母中异源表达，再将筛选出的野生型菌株进行产酶条件优化;之后以嗜热甘露聚糖酶BK01的Loop区为研究对象，对Loop区的分子特征进行统计分析;结合分子动力学模拟、定点突变等技术，确定影响嗜热甘露聚糖酶BK01热稳定性的关键Loop区。具体实验结果如下:
　　1.来源于Aspergillus niger BK01的甘露聚糖酶BK01，编码区全长1035bp，编码345个氨基酸，成熟蛋白理论分子量为37.96kDa，其等电点(pI)为4.96。经密码子优化后的ManBK01野生型基因在毕赤酵母中实现了分泌表达。利用响应面分析法将BK01野生型工程菌的产酶条件优化为:甲醇诱导浓度1.0％、诱导温度25℃、培养基起始pH5.5，在此条件下嗜热甘露聚糖酶BK01的酶活力为2.02U/mL，是未优化前的2倍。对ManBK01野生型重组酶进行酶学性质分析发现:重组酶的最适温度为80℃，最适pH为5.0，动力学常数Km值为1.40mg/mL、Vmax值为149.25μmol/(min·mg)，它在70℃、85℃和95℃下半衰期分别为346.57min（即5.78h）、30.00min和4.06min。
　　2.以嗜热甘露聚糖酶BK01的Loop区为研究对象，结合分子动力学模拟结果，找到了疑似影响ManBK01热稳定性的6个Loop区:LoopⅡ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ。
　　3.对上述6个Loop区加长或截短（LoopⅣ、Ⅵ和Ⅶ加长，LoopⅡ、Ⅴ和Ⅷ截短），采用定点突变技术构建了长度突变体BK01-Ⅱ、BK01-Ⅳ、BK01-Ⅴ、BK01-Ⅵ、BK01-Ⅶ和BK01-Ⅷ,并在毕赤酵母GS115成功的分泌表达，重组酶BK01-Ⅶ丧失活性。通过与野生型重组酶半衰期的对比发现，突变酶BK01-Ⅷ在85℃和95℃条件下的半衰期分别提高了1.80％和15.27％，表现出最好的热稳定性。综合上述结果与分析，将LoopⅧ确定为影响嗜热甘露聚糖酶BK01热稳定性的关键Loop区。
　　4.采用定点突变的方法将6个Loop区中的脯氨酸突变为甘氨酸，构建了柔性突变体BK01-P63G、BK01-P169G、BK01-P172G、BK01-P217G、BK01-P244G和BK01-P318G,并在毕赤酵母GS115成功的分泌表达，重组酶BK01-P217G和BK01-P318G丧失活性。通过与野生型重组酶半衰期的对比发现，4个柔性突变酶的热稳定性均比野生型重组酶差;其中突变酶BK01-P169G的热稳定性最差，并且它与底物的亲和力也最小，突变点169位于LoopⅣ。综上结果，将LoopⅣ确定为影响嗜热甘露聚糖酶BK01热稳定性的关键Loop区。
　　本研究将密码子优化后的嗜热甘露聚糖酶BK01野生型基因成功的在毕赤酵母中分泌表达，并且通过产酶条件的优化，提高了酶的表达量;以ManBK01的Loop区为研究对象，采用定点突变技术构建了6个Loop长度突变体和6个Loop柔性突变体，通过比较突变酶和野生型重组酶的半衰期，找到了影响ManBK01热稳定性的两个关键Loop区:LoopⅣ和LoopⅧ。本研究不仅可以丰富嗜热酶的热稳定理论，也为寻求新的提高酶热稳定性的策略提供一定的理论指导。