论文部分内容阅读
研究目的：观察双孔钾通道TREK-1在正常和缺氧培养条件下在大鼠皮层神经细胞中的表达；同时研究TREK-1的活性对星形胶质细胞再摄取谷氨酸、分泌释放炎症介质S100和增殖活化等功能的影响及其在缺血缺氧损伤中的神经保护作用；为了排除通道阻断剂的非特异性作用,选择特异性的调控TREK-1的活性,将化学合成的siRNA转染于星形胶质细胞从而特异性的抑制TREK-1的活性,为今后研究TREK-1通道与培养的星形胶质细胞的功能提供有力的工具。研究方法：离体培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞,并通过细胞免疫荧光染色法分别观察TREK-1在神经元和星形胶质细胞中的表达。对培养的星形胶质细胞进行缺氧干预,通过Real-time PCR、免疫荧光染色法和蛋白免疫印迹法分别在基因水平和蛋白水平检测(?) TREK-1在星形胶质细胞缺氧不同时间点的表达变化趋势。通过TREK-1通道相对选择性的阻断剂——奎宁和布比卡因抑制缺氧和正常条件下纯化培养的星形胶质细胞中的TREK-1的活性,利用比色法观察其对星形胶质细胞再摄取谷氨酸能力的影响；通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测(?)TREK-1活性对缺氧诱导的星形胶质细胞释放S100的影响,通过BrdU染色和流式细胞分析术检测(?) TREK-1活性对缺氧诱导的星形胶质细胞活化增殖的影响。建立神经元与星形胶质细胞的共培养体系,通过末端转移酶标记技术(TUNEL)乏观察TREK-1通道在脑缺血损伤中的神经保护作用。将化学合成的荧光标记的dsRNA转染于纯化培养的星形胶质细胞,观察其转染效率与浓度的关系。在优化浓度下,将化学合成的3对选择特异性针对TREK-1的siRNA片段转染于星形胶质细胞,通过细胞免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测,筛选出沉默效率最佳的siRNA片段。研究结果：在正常培养条件下TREK-1通道在神经元和星形胶质细胞均有表达,在缺氧损伤的早期TREK-1在星形胶质细胞中的表达有上升趋势,随着缺血时间的增加,其表达又逐渐下降。在正常和缺氧条件下,TREK-1抑制剂奎宁(200μM)和布比卡因(500μM)均可以抑制星形胶质细胞的再摄取谷氨酸的能力,同时,还可以显著的增加缺氧诱导的星形胶质细胞分泌S100和星形胶质细胞的活化增殖。除此之外,TREK-1抑制剂还可以增加神经元和星形胶质细胞的共培养中神经元的凋亡率。化学合成的特异性针对TREK-1的siT2可以明显抑制星形胶质细胞中TREK-1的表达。研究结论：星形胶质细胞TREK-1的表达及活性对其平衡缓冲功能具有重要影响,是潜在的基于星形胶质细胞的脑卒中治疗靶点。选择特异性针对TREK-1的siRNA片段siT2转染于星形胶质细胞后可以明显抑制其表达。