论文部分内容阅读
目的:结直肠癌是目前临床常见的一种恶性肿瘤,是第三大最常见的导致高死亡率的癌症。结直肠癌每年约造成近50万人死亡,占全球癌症发病率的近10%和所有癌症死亡的8%。结直肠癌的发病机制涉及多种基因,多个因子,多种信号通路,其发生发展是多因素相互调控的结果发病机制十分复杂。microRNA是一种小的非编码RNA,能够识别并结合其目标mRNA的部分互补序列,导致mRNA的降解或其翻译的抑制。越来越多的研究表明,mRNA在不同的癌症中通常表现为异常表达,因而在肿瘤中发挥着促癌或者抑癌的作用。现有研究表明,miR-320a在胃癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达异常下调,其作为一种肿瘤抑制性miRNA,但是关于其在结直肠癌中的研究却相对很少。因此,鉴定miR-320a对结直肠癌细胞生物学行为的影响及下游靶基因鉴定是探索结直肠癌发病机制的一个重要方向。方法:miR-320a过表达病毒感染DLD1与SW620两株结直肠癌细胞,荧光显微镜观察荧光表达情况并进行qRT-PCR实验验证miR-320a过表达水平。CCK-8实验验证结直肠癌细胞的增殖能力、细胞克隆形成实验验证结直肠癌细胞的克隆形成能力、划痕实验验证结直肠癌细胞的迁移能力、Transwell实验验证结直肠癌细胞的侵袭能力。免疫印迹实验检测在结直肠癌中随mir-320a过表达而发生表达水平变化的相关蛋白。qRT-PCR实验验证相关蛋白mRNA水平的变化。荧光素酶报告基因检测试验验证miR-320a下游靶基因。结果:我们利用miR-320a过表达载体质粒获取病毒,并感染结直肠癌细胞DLD1和SW620细胞,成功获得的了稳定过表达miR-320a的结直肠癌细胞。对稳转细胞进行细胞生物学功能实验,发现mi R-320a稳定过表达抑制了结直肠细胞的增殖,克隆、迁移以及侵袭能力,说明mi R-320a在结直肠癌中是作为抑制基因而存在的,能够抑制结直肠癌的发生发展。通过免疫印迹实验发现三个随miR-320a过表达而下调的蛋白MACC1、Sp1以及FOXQ1,说明这三个蛋白的基因可能受miR-320a的调控。另外qRT-PCR实验发现Sp1在mRNA水平下调也比较明显,miR-320a可能直接靶向调控Sp1。荧光素酶报告基因检测结果表明Sp1是miR-320a的下游靶基因。