论文部分内容阅读
眼科表面麻醉剂随着眼科手术技术和设备的发展得到了越来越广泛的应用，因此，其对角膜的毒副作用越来越得到大家的关注，其中，最常用的两种表面麻醉剂是爱尔卡因和盐酸奥布卡因。角膜主要由内皮、基质、上皮及其衍生物组成，而哺乳动物（除兔以外）的角膜内皮细胞在成年后即失去再生能力，因此，人角膜内皮细胞（HCEC）的损伤是不可修复的，对于HCEC的研究更是重中之重。目前，关于眼科表面麻醉剂对HCEC影响作用的研究主要是通过动物实验进行，耗资大耗时多，在很大程度上制约了研究的范围及进程，而至今仍未见有关用HCEC进行体外表麻研究的报道。本文以人角膜内皮细胞系（HCEC细胞系）为体外研究体系研究了爱尔卡因和盐酸奥布卡因对HCEC的影响作用，为了进一步证明这两种麻醉剂对于活体HCEC的毒副作用，本文选用爱尔卡因为研究对象，以家猫为实验动物进行了体内毒性作用研究，最终根据体外和体内实验的研究结果准确评价出这两种表面麻醉剂对HCEC的毒副作用，进一步为爱尔卡因和盐酸奥布卡因的临床应用提供实验依据。体外培养的HCEC经156.25mg/L~5g/L梯度稀释的爱尔卡因处理后的光镜观察发现，浓度高于312.5mg/L的爱尔卡因，可引起HCEC出现细胞皱缩、胞内空泡化、脱落和死亡等变化，而浓度低于156.25mg/L时则细胞形态变化不显著，证明爱尔卡因在浓度高于312.5mg/L时对HCEC具有显著的细胞毒性。156.25mg/L~5g/L梯度稀释的爱尔卡因处理组HCEC的吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）荧光双染色结果表明，HCEC的凋亡率具有浓度和时间依赖性，2.5g/L和5g/L爱尔卡因处理组HCEC分别于24h和16h后细胞凋亡率达100%，312.5mg/L、625mg/L、1.25g/L爱尔卡因处理组HCEC的凋亡率在12h时达到最高，分别为17.9%、49.2%和58.5%，从而证明爱尔卡因在浓度高于312.5mg/L时能显著诱导HCEC质膜通透性的增大。312.5mg/L~5g/L爱尔卡因处理组HCEC的DNA样品琼脂糖凝胶电泳结果显示，625mg/L~5g/L爱尔卡因处理组的HCEC，其DNA出现了典型的梯状条带，证明爱尔卡因在浓度高于625mg/L时能显著诱导HCEC发生DNA断片化，而浓度低于312.5mg/L时其DNA未出现梯状条带。1.25g/L爱尔卡因处理12h后的HCEC样品的透射电镜观察结果显示，其细胞结构紊乱，出现了胞质空泡化、染色质固缩在核内边缘化及凋亡小体形成等显著的细胞凋亡特征，证明1.25g/L爱尔卡因处理后的HCEC具有细胞凋亡的超微结构特征。上述研究结果证实，爱尔卡因在浓度高于312.5mg/L时能显著诱导体外培养的HCEC发生凋亡。7.8125mg/L~4g/L盐酸奥布卡因对体外培养的HCEC影响作用的研究结果显示，光镜下，浓度高于62.5mg/L盐酸奥布卡因处理的HCEC出现了细胞皱缩、胞内空泡化、脱落和死亡等现象，而浓度低于31.25mg/L时细胞形态和数量无显著变化，证明盐酸奥布卡因在浓度高于62.5mg/L时对HCEC具有显著的细胞毒性。AO/EB荧光双染色结果显示，HCEC的细胞凋亡率的变化具有浓度和时间依赖性，125mg/L~4g/L盐酸奥布卡因处理组HCEC的凋亡率均随浓度的增大和时间的延长而逐渐升高，均在不同时间内达到100%，62.5mg/L盐酸奥布卡因处理组的HCEC在12h时凋亡率达到最高，证明盐酸奥布卡因在浓度高于62.5mg/L时能显著诱导HCEC质膜通透性的增大。125mg/L~4g/L盐酸奥布卡因处理组HCEC在DNA琼脂糖凝胶电泳中出现了典型的梯状条带，证明盐酸奥布卡因在浓度高于125mg/L时能显著诱导HCEC发生DNA断片化，而浓度低于62.5mg/L时其DNA未出现梯状条带。125mg/L盐酸奥布卡因处理16h后的HCEC样品的透射电镜观察结果显示，其细胞结构紊乱，出现了胞内空泡化、染色质固缩在核内边缘化和凋亡小体形成等显著的细胞凋亡特征，证明125mg/L盐酸奥布卡因处理后的HCEC具有细胞凋亡的超微结构特征。综合上述研究结果，证实盐酸奥布卡因在浓度高于62.5mg/L时能显著诱导体外培养HCEC发生细胞凋亡。为了验证这两种表面麻醉剂在活体中对角膜内皮细胞具有凋亡诱导作用，本文选取爱尔卡因进行了家猫角膜的在体检测和离体鉴定。按照爱尔卡因的临床使用浓度5g/L表面麻醉家猫眼球，每5d进行内皮镜检测，结果显示，表面麻醉5d后，实验眼角膜内皮细胞密度减少，角膜内皮细胞平均面积增大，均与对照眼差异显著（P<0.05），CV值上升，六角形细胞比率下降，但与对照眼相比差别均无统计学意义（P>0.05），表面麻醉25d后，实验眼各指标变化均趋于平缓。表面麻醉40d后取家猫角膜进行离体鉴定，茜素红染色结果显示，家猫实验眼角膜内皮细胞六角形比率明显下降，部分区域细胞面积明显变大。扫描电镜结果显示实验眼角膜有少量内皮细胞皱缩，细胞发生凋亡。综合以上研究结果，证实5g/L爱尔卡因表面麻醉确对角膜内皮细胞具有凋亡诱导作用。本文以非转染HCEC细胞系为理想的体外研究体系，探讨了爱尔卡因和盐酸奥布卡因对HCEC的凋亡诱导作用，证实了爱尔卡因和盐酸奥布卡因能够诱导HCEC发生凋亡，并通过爱尔卡因的家猫在体实验和家猫角膜离体鉴定验证了爱尔卡因临床使用浓度确可引起角膜内皮细胞发生凋亡，对角膜内皮细胞具有较大的毒性作用。因此，临床应用时应避免使用爱尔卡因和盐酸奥布卡因，或使用无毒副作用的眼科表面麻醉剂。同时，本文利用HCEC细胞系为模型为无毒副作用的眼科表面麻醉剂的研发提供了实验依据。