论文部分内容阅读
食管癌的死亡率位居我国恶性肿瘤的第四位。为了寻找与食管癌关系密切的分子改变,本研究对食管癌及其手术切端粘膜组织进行了蛋白组学分析,得到了22个具有统计学意义的食管癌异常表达蛋白。从中挑选了5个可能在肿瘤发生发展过程中发挥作用的候选蛋白,包括calreticulin、heat shock 70-kDa protein 5（GRP78）、Hsp27、annexin V和M2-PK。首先利用Western blot在4对食管癌组织和配对切端粘膜组织中作了验证检测,结果发现calreticulin、GRP78、annexinV和M2-PK蛋白均在食管癌组织中存在过表达,而Hsp27在癌组织中表达下调。进一步利用免疫组织化学技术分析了近90例配对食管癌组织标本,发现calreticulin、GRP78、annexin V、M2-PK和Hsp27蛋白在食管癌组织中的异常表达均高于30%。Kaplan-Meier和log rank生存分析表明calreticulin和GRP78蛋白高表达均与食管癌患者的不良预后显著相关。Calreticulin（CALR）是一个多功能的钙离子结合蛋白,参与蛋白质折叠、内质网钙离子的贮存和释放等多种细胞生命过程,我们对该蛋白在食管癌细胞中的作用进行了深入的研究。体外实验表明CALR-siRNA介导的CALR表达抑制不影响食管癌细胞的增殖和周期进展,但可抑制细胞运动穿膜、Matrigel侵袭、软琼脂集落形成和抗失巢凋亡能力,而且CALR过表达可以增加食管癌细胞的抗失巢凋亡能力。体内实验显示,降低CALR表达可抑制裸鼠皮下瘤生长。进一步的分子机制研究发现,抑制CALR可以减弱F-actin的聚合并降低p63和粘着斑重要组分paxillin蛋白的表达。我们的前期研究发现,细胞骨架相关蛋白Cortactin（CTTN）也是通过增加肿瘤细胞抗失巢凋亡的能力而促进食管癌的侵袭和转移。本研究结果显示,抑制CALR蛋白可以降低CTTN的mRNA及蛋白表达,而CTTN蛋白降低不影响CALR蛋白的表达。生物信息学分析CTTN基因上游启动子序列,显示存在多个STAT3的保守结合位点,而且我们发现抑制CALR蛋白表达可以抑制STAT3(Tyr705)的磷酸化水平。JAK激酶抑制剂AG490处理细胞后可以降低CTTN蛋白而对CALR蛋白表达没有影响。染色质免疫沉淀实验显示,STAT3结合于CTTN基因上游-1003到-996位的TTATGAA保守序列。提示CALR可以作为上游分子,通过CALR-STAT3-CTTN途径调节CTTN基因的转录。利用激光共聚焦和Co-IP技术还发现CALR和CTTN蛋白存在共定位和共沉淀,但是CALR并不影响CTTN蛋白的降解。本研究首次发现降低CALR表达可以抑制体内外肿瘤细胞的恶性表型,尤其揭示了CALR促进食管癌细胞的运动、侵袭和抵抗失巢凋亡等一系列新功能。CALR可以通过调节PI3K/Akt途径,并且间接通过STAT3调节CTTN的转录,同时影响paxillin、p63的表达,赋予其高表达肿瘤细胞较强的运动能力和保护其脱离基质后免于失巢凋亡。