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虫草是一种名贵的中药保健品,鉴于天然虫草日益减少,故研究和开发人工培养的虫草制品有其重要的使用价值,开展对虫草药理和生物活性的研究有助于提高生产效率并改进发酵制品的医疗和保健功能。本实验主要开展冬虫夏草菌丝体化学成分分析,优化蛹虫草菌丝体累积核苷和碱基,天然虫草及其发酵制品抗氧化能力测定以及蛹虫草菌丝体胞外几丁质酶的研究。其中关于虫草减轻细胞氧化损伤的作用及其胞外几丁质酶的研究尚未查阅到相关文献报道。
本研究对一种在肾衰竭治疗中有良好治疗作用的冬虫夏草固体发酵菌丝粉进行了分析,显示其氨基酸和主要化学成份的含量与天然冬虫夏草子实体基本一致。具体而言,样品含虫草所特有的3'-脱氧腺苷40.81μg/g,甘露醇165.8mg/g,多糖157.3mg/g;样品中不饱和脂肪酸为优势脂肪酸,以亚油酸和油酸的含量较高。多种生物活性成分的含量如3'-脱氧腺苷、甘露醇等都高于天然冬虫夏草。
本研究考察了碳源、氮源、金属离子和培养时间对于发酵蛹虫草菌丝体生物量和7种核苷、碱基含量的影响。实验证明蛹虫草生物量以及这些活性成分的含量主要取决于碳源,而非氮源。经优化后的培养条件为:20﹪土豆汁加2﹪葡萄糖为碳源,0.3﹪酵母膏加0.3﹪蛋白胨为氮源,并加入0.1mmol/LMn2+,最佳的培养时间为6天。在此条件下菌丝体中腺苷和3'-脱氧腺苷在含量分别为5.05、0.212mg/g,气生菌丝体中分别为8.25、4.98mg/g,均比优化前有较大提高。
对蛹虫草菌丝体发酵周期中细胞氧化-还原状态和抗氧化活性的研究表明在对数生长前期之前,细胞的脂氧化水平较低,从静止期起则明显升高。胞内的超氧阴离子主要依靠SOD清除,而非酶类抗氧化物质可以协同CAT一起参与过氧化氢的清除。
实验考察了天然冬虫夏草、蛹虫草及其发酵制品提取物的体外抗氧化活性、减轻自由基诱导的细胞氧化损伤的能力。研究表明天然蛹虫草水提取物的抗氧化能力最高,虫草总体表现出的抗氧化能力和实验所测定的任一类抗氧化成分的含量都不简单地成正比关系。推测虫草对与细胞氧化损伤的抑制作用来源于它能够清除胞内ROS并提升胞内SOD和CAT等抗氧化酶的活性。
胞外几丁质酶对于虫草侵染宿主的过程是十分重要的,提高几丁质酶活性能在一定程度上提高人工培养虫草子实体的成功率。研究考察了多种碳源、氮源、金属离子、表面活性剂、初始培养基pH和培养时间对于蛹虫草发酵菌丝体胞外几丁质酶活性的影响。以几丁质为碳源培养时,蛹虫草胞外几丁质酶与菌丝体的生长密切相关,酶活在生长的稳定期达到最高。几丁质是酶诱导的一个关键因素,在1﹪胶状几丁质为碳源、0.1﹪酵母膏为氮源、初始培养基pH6.0的条件下酶的活性最高。优化后的培养条件可使酶活提高到12.0mU/ml以上,相比较而言在有充足营养成分但不含几丁质的完全培养基上生长的蛹虫草菌丝体胞外几丁质酶的活性均在1.0mU/ml以下。经超滤和SephadexG-100分子筛初步分离纯化的酶最佳反应pH为6.0,最佳反应温度40℃;酶保存下在pH7.0和5℃时较为稳定。1mmol/LEDTA和多数金属离子的存在对酶活没有显著影响,而Cu2+和Hg2+能抑制酶活性的发挥。