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胚胎干细胞具有自我更新及多向分化潜能,为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。由于其应用价值,科学家们曾尝试通过不同途径实现体细胞重编程以获取ES细胞或ES细胞样的细胞或多潜能干细胞(Induced pluripotentstem cells,iPS cells),这些途径主要包括体细胞核移植、体细胞与多潜能细胞融合后的重编程、将分化的体细胞在卵细胞或多潜能干细胞的抽提物中孵育以实现体细胞重编程、体细胞经特定因子诱导重编程为iPS细胞。虽然运用前三种方法可以获得多潜能干细胞,但是这些方法的广泛应用在技术、细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等方面存在诸多限制,而iPS细胞不受这些问题的限制,且制备简单易行;相对体细胞核移植技术而言,iPS细胞技术为体细胞和肿瘤细胞重编程机制研究提供了理想而简便的体外研究体系,正因为iPS细胞技术的独特优势,以前采用体细胞核移植技术研究体细胞和肿瘤细胞重编程机制的科学家纷纷放弃该技术,转而采用iPS细胞技术。鉴于此,本试验拟借助慢病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs),进而将其重编程为iPS细胞,以实现下列目标:(1)熟练掌握基于慢病毒载体法将体细胞重编程为iPS细胞的技术,以为下一步利用iPS细胞技术研究肿瘤细胞重编程机制提供技术保障;(2)建立小鼠iPS细胞系,以为后续研究[如iPS细胞生物学特性和行为(如自我复制、增殖和分化等)调控机制研究)奠定基础。目的:借助慢病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs),进而将其重编程为iPS细胞,以实现多种目的(见上)。方法:1慢病毒载体pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W的鉴定酶切鉴定分别使用EcoRⅠ、KpnⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ对pHAGE2-EF1α-STEMMCA进行酶切,分别使用EcoRⅠ、PvuⅡ和BamHⅠ、XhoⅠ对pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W进行酶切;酶切产物进行0.6%琼脂糖凝胶电泳。PCR鉴定根据Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列设计引物分别扩增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因;PCR扩增后,取5μl反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳。2慢病毒生产与成功生产鉴定慢病毒包装与浓缩按标准程序进行慢病毒包装(脂质体介导的瞬时转染)、超速离心浓缩和保存等。慢病毒成功生产的鉴定用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光。3利用细胞模型在体外验证EGFP能否正常表达用病毒上清感染MEFs,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光。4慢病毒载体法重编程MEFs为iPS细胞用浓缩病毒感染携带有Pou5f1-EGFP基因的MEFs,12h后弃病毒感染液,更换为鼠ES细胞培基,之后每天更换培基直到第二十天克隆足够大时挑克隆扩大培养。5鼠iPS细胞建系及其生物学特性鉴定1) iPS细胞克隆上绿色荧光蛋白基因表达情况2)所有iPS细胞系传代培养至第5代后,进行AKP染色鉴定;3)提取iPS细胞总RNA,并进而通过RT-PCR检测鼠ES细胞标志性基因表达;4)悬浮培养观察拟胚体形成及分化情况;5) iPS细胞接种至SCID小鼠皮下,观察畸胎瘤形成情况。结果:1慢病毒载体pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W鉴定酶切鉴定pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W经EcoRⅠ单酶切,酶切产物经0.6%琼脂糖凝胶电泳均可见一条预期大小的条带;pHAGE2-EF1α-STEMMCA经KpnⅠ单酶切和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切酶切产物经0.6%琼脂糖凝胶电泳均可见两条预期大小的条带;pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W经PvuⅡ单酶切和BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物经0.6%琼脂糖凝胶电泳均可见两条预期大小的条带。PCR鉴定以质粒pHAGE2-EF1α-STEMMCA为模板,分别扩增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因,PCR产物大小均与预期值相符。2慢病毒包装、浓缩及鉴定携带EGFP基因慢病毒的生产与鉴定将pHAGE2-EFlaFull-ZsGreen-W与病毒包装质粒共转染293FT细胞,48h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,预示转染成功。用收集的病毒上清感染293FT细胞,48h后倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光,这进一步说明病毒已成功生产;同时也表明EGFP转基因能够正常表达。携带Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因的慢病毒生产与鉴定将pHAGE2-EF1α-STEMMCA与病毒包装质粒共转染293FT细胞,48h后倒置荧光显微镜下可见合包体和细胞融合现象,预示病毒正在生产。3利用细胞模型在体外验证EGFP能否正常表达用携带EGFP基因的慢病毒感染MEFs,48h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光,这表明转基因EGFP在MEFs内能够正常表达。4慢病毒载体法重编程MEFs为iPS细胞病毒感染后第4天可见到ES克隆出现,第20天克隆足够大可以挑克隆以扩大培养,预示着MEFs已开始重编程。5.iPS细胞生物学特性鉴定1)第9天可见到有绿色荧光的iPS细胞克隆出现;2) 4株iPS细胞系均具有典型的ES细胞克隆形态,AKP染色呈强阳性;3) 4株iPS细胞系均表达ES细胞特有的标志性基因;4) 4株iPS细胞系均具有体外分化形成囊性拟胚体的能力,且可以分化为心肌细胞;5) 4株iPS细胞系均能形成畸胎瘤。结论:1.运用Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2四种基因成功将MEFs重编程为iPS细胞。2.4株iPS细胞系均具有鼠ES细胞的一些生物学特,且在体外长期传代中能够维持此特性,初步证明建立了小鼠iPS细胞系。