甘蓝型油菜(Brassica napus L,2n=4x=38,AACC)是由白菜型油菜(B.rapa,2n=2x=20,AA)与甘蓝(B.oleracea,2n=2x=18,CC)自然杂交后双倍化得到的异源四倍体物种。它富含油脂和蛋白质,是全世界范围内广泛种植的重要油料作物之一。甘蓝型油菜不仅是重要的食用油,调味品和蛋白质饲料来源,也是加工工业及生物能源的重要原料,而且可以为人类提供必要的维生素C和可溶性纤维。核盘菌引起的油菜茎秆腐烂是油菜生产中的首要病害,可以造成油菜产量降低和品质下降;另外,油菜的倒伏问题已成为制约油菜机械化收获、影响产量和品质、增加菌核病危害的重要因素之一。木质素不仅可以增强植物体的机械强度,同时由于其疏水的化学特性,使植物免受病原菌的侵害和扩展,与植物抗病、抗倒伏有重要的关系。因此,研究甘蓝型油菜茎秆木质素在抗病和抗倒伏过程中的作用,鉴定抗性候选基因,可为油菜抗性育种提供理论基础。本研究首先根据甘蓝型油菜茎秆中的酸性洗涤木质素(ADL)和木质素单体(G、S)含量值,建立近红外模型,实现样品中ADL和木质素单体含量的快速测定;利用60K Brassica Illumina SNP芯片对茎秆菌核病抗性和抗倒伏性状(茎秆直径、折断力和折断强度)及木质素和木质素单体含量进行全基因组关联分析,鉴定与抗性性状相关联的SNP位点及候选基因,并从转录组水平解析木质素合成及甘蓝型油菜抗病机理,具体研究结果如下:1.ADL和木质素单体含量近红外模型建立近红外光谱是一种快速、无损准确的测定植物化学成分的新方法,本研究采用范式测定法测定了103份材料的茎秆ADL含量,采用GC-MS法测定了152份材料的木质素单体含量,然后采集这些材料的近红外数据,根据马氏距离选择83份材料来建立ADL定标模型,选择67份材料建立S型木质素单体和G型木质素单体模型,其余材料用于外部验证。结果表明:(1)ADL最适模型为MPLS回归分析,无散射和二阶导数处理;S型和G型木质素单体最适模型为PLS回归分析,标准正常化和散射处理(SNV+Detrend)及二阶导数处理。(2)ADL模型决定系数(1-VR)约为0.90,外部验证相关系数(RSQ)分别为0.87;G和S型木质素单体交互验证决定系数(1-VR)为0.97,外部验证预测相关系数(RSQ)为0.86;表明本试验中,ADL、S型和G型木质素单体近红外模型具有较好的预测效果,可以用于精确定量。2.抗性相关性状全基因组关联分析为了从全基因组水平上解析甘蓝型油菜抗病和抗倒伏机理,挖掘与抗性性状相关联的SNP位点,本研究以520份不同来源甘蓝型油菜为材料,进行菌核病茎秆抗性鉴定,并测定茎秆中部直径,折断力,抗折强度(单位面积折断力)及倒伏系数;根据上述建立的ADL、S型和G型木质素单体近红外模型,测定各材料的ADL含量、S型和G型木质素单体含量,由于H型木质素单体含量很少,本研究后续分析从S型和G型木质素单体比例(S/G)入手,探讨木质素单体比例与抗性的关系。这7个性状都进行两年两次重复鉴定,同时利用60K Brassica Illumina SNP芯片分析的基因型,进行甘蓝型油菜抗性相关性状的全基因组关联分析。结果表明:(1)甘蓝型油菜相对感病性与茎秆总木质素含量无关,但与木质素单体比S/G达到显著正相关;茎秆直径与折断力达到显著正相关;茎秆折断力和抗折强度与ADL木质素总含量正相关;茎秆ADL木质素总量与木质素单体比S/G达到极显著正相关,倒伏系数与抗折强度和木质素单体比S/G达到显著正相关。表明组成油菜茎秆木质素时,S型木质素单体含量较高,但G型木质素单体在抗病和抗倒伏过程中起着重要作用,抗折强度可以作为评价倒伏的重要指标。(2)从60K SNP芯片中筛选出31468个有多态性和高质量的SNP分析连锁不平衡衰减距离。当LD的衰减阈值为0.1时,A基因组的衰退距离约为1 Mb,C基因组的衰退距离约为10 Mb,表明A基因组较C基因组衰减速度快,可能是中国半冬性甘蓝型油菜在育种中A基因组发生较大重组,打破了连锁不平衡。(3)根据SNP在染色体上位置,检测各染色体单体型分布情况。A和C基因组平均单体型块大小分别为133.3 kb和177.5 kb(F=8.5,P=0.019);A基因组每100 kb内单体型块数目平均为0.18,C基因组为0.04(F=102.5,P<0.01)。A基因组单体型块数目多,长度短,C基因组单体型块数目少,长度长,表明A基因组较C基因组发生较大重组,打破之前的连锁状态,被分割为多个长度小的单体型块。(4)通过群体遗传结构,Neighbor-join进化树及主成分分析划分自然群体类群。520份材料划分为3个类群,亚群1(Group 1)包含53份材料,亚群2(Group2)包含348份材料,剩余的119份材料聚入混合亚群(Mixed),其分类与甘蓝型油菜生态型一致。亚群1主要是由分布在中国甘肃和青海地区及欧洲的春油菜构成,亚群2主要是由分布在长江流域地区的半冬性油菜构成,包括重庆、四川、湖南、湖北及江苏地区选育的品种。(5)对7个抗性相关性状表型和60K Brassica Illumina SNP芯片分析的基因型进行全基因组关联分析,共检测到109个显著关联的SNP位点。茎秆菌核病抗性利用K+P模型,鉴定出17个与抗性显著关联的SNP位点,分别位于A8染色体上的15.1 Mb和C6的31.3 Mb位置,A8上与菌核病抗性显著关联的SNP位点位于长度为409 kb的单型体内,C6染色体上的SNP位点,与已经报道的菌核病QTL位点有重叠;茎秆中部直径利用K+Q模型,共检测到3个SNP标记与直径显著关联,分别位于A2(6 Mb)和A7(18.5 Mb)染色体上;茎秆折断力利用K+P和K+Q模型共检测到关联的11个SNP,位于A2染色体上约24.1 Mb,A7染色体上约20.9 Mb,A9染色体上约2.5 Mb和2.9 Mb,及C3染色体上约48.4 Mb;对抗折强度,检测到7个与抗折强度相关联的SNP位点位于A1染色体18 Mb,A5染色体20.3 Mb,A7染色体20.9 Mb;对倒伏系数,检测到5个与倒伏系数关联SNP位点;对ADL,找到8个与木质素含量关联的SNP位点;对木质素单体比S/G,几乎在所有染色体都找到与其关联的SNP位点,共找到58个显著关联SNP位点(P<1.37×10-5),当利用较为严格的阈值时(P<1.58×10-6),共找到6个关联SNP位点,位于A3染色体6.9 Mb和14.7-18.4 Mb,A6染色体17.9 Mb,A7染色体11.1 Mb。另外ADL木质素与木质素单体比S/G都在A1染色体约1.0Mb处找到显著关联的SNP位点,并在附近找到与CAD5同源基因(Bna A01g02890D)。倒伏系数LC与木质素单体比S/G,相对感病性与木质素单体比S/G都找到共同的显著关联SNP位点,表明木质素单体在抗性过程中起着重要作用。(6)对7个抗性性状进行全基因组选择,7个性状随着参考材料数目的增加预测能力升高,但是标准差也随着升高,结合预测能力和标准差,选用60%的参考材料时最为合适。利用所有标记进行全基因组选择时,这些性状的预测效率为0.23(直径)-0.42(折断力),预测效率很低;利用全基因组关联分析显著SNP位点(P<0.05)进行全基因组预测时,相对感病性,预测能力为0.8,茎秆中部直径、折断力、抗折强度、ADL、木质素单体比S/G预测能力都约为0.6-0.7,说明这些标记具有预测能力,全基因关联分析检测的显著关联位点可以提高性状预测能力,促进全基因组选择进程。3.甘蓝型油菜木质素合成基因表达差异分析为了了解甘蓝型油菜茎秆木质素合成过程中基因表达情况,本研究从520份材料中各选取5份高木质素含量和低木质素含量材料,在初花期取茎秆中部组织,利用高通量RNA-Seq测序技术构建了油菜低木质素(L1)和高木质素(H2)转录组文库,找到与木质素合成相关的途径及基因。主要研究结果如下:与低木质素含量材料FPKM相比后,寻找表达值相差至少2倍的差异基因(|log2(H2/L1)|≥1,FDR<0.01),与木质素合成相关的差异表达基因共1013个,其中上调基因351个,下调基因662个。DGEs的GO富集分析进行统计检验,结果表明,与低木质素材料中的基因相比,高木质素材料上调基因位于细胞器,主要分子功能是转运活性(transporter activity),主要参与在糖苷分解代谢过程(尤其是硫苷分解),叶片衰老和细胞壁生物合成过程中;下调基因主要参与次级代谢过程和硫苷生物合成过程中,表明硫苷代谢途径与木质素合成途径相关。另外,对这些基因进行KEGG富集分析,上调表达基因中,没有代谢途径达到显著富集水平;而下调表达基因有11个代谢途径达到显著富集水平。显著富集的前5个代谢途径为硫苷生物合成(ath00966)、氧带羧酸代谢(ath01210)、硫代谢(ath00920)、硫胺素代谢(ath00730)和类黄酮代谢(ath00941),这个结果与GO富集分析结果一致。另外,我们还鉴定了一些在其他作物木质素代谢途径中起着重要作用的转录因子基因(如MYB85和MYB103),也可以调控甘蓝型油菜木质素的生物合成。结合全基因组关联分析,找到4CL5同源基因(Bna A03g36130D)。另外,我们还找到一个ERF转录因子基因SHINE(Bna A08g233880D),其可能参与木质素生物合成。4.甘蓝型油菜应答核盘菌侵染的转录组分析为了从转录水平解析甘蓝型油菜抗病机制,我们从520份材料中分别选择5份极端抗病(R)和感病(S)甘蓝型油菜,核盘菌胁迫接种茎秆48 h,分别取抗病材料和感病材料接种前后各10株混合样提RNA,利用RNA-seq技术进行转录组测序,得到抗、感材料核盘菌胁迫处理后上调和下调的基因,结果如下:(1)根据|log2(FPKM48/FPKM0)|≥2,FDR<0.01,R和S材料中接种前后共发现6821个差异基因,R中有5384个差异表达基因,包括2356个上调基因(43.8%)和3028个下调基因(56.2%);感病性材料(S)中共5386个,包括2229个上调基因(41.4%),3157个下调基因(58.6%)。其中共有的上调基因1784个,572个基因在R材料中特异上调,445个基因在S材料中特异上调;R和S材料共同下调的基因则有2166个,R材料特异下调基因862个,S材料特异下调基因991个。另外,对所有差异基因进行分层聚类发现,R和S材料中差异基因表达模式一致,基因表达水平的差异主要表现为上调或下调倍数的差异;(2)对共同表达差异基因进行了GO功能富集,从细胞组分,分子功能和参与的生物过程三个方面来分析。共同表达的上调基因主要在细胞部分(cell),其分子功能是催化和结合功能,编码转运蛋白,参与的生物过程为代谢过程,细胞过程,生物调节和对刺激的反应。而下调的基因除了在细胞上,细胞器上的比例也很高,主要是与光合作用相关的叶绿体及类囊体;(3)对抗病和感病中共同表达的差异基因KEGG代谢途径分析,结果表明,上调基因主要富集在谷胱甘肽代谢和次级代谢生物合成(硫代谢,硫苷生物合成和氧带羧酸代谢中),下调基因主要富集在光合作用,乙醛酸和二羧酸代谢途径,固碳作用,叶绿素代谢过程和碳代谢过程中;(4)对抗病和感病材料差异表达基因进行分析,找到一些特异的与抗性相关的途径及基因,包括茉莉酸途径,木质素途径,信号传导途径,防御反应及转录因子基因。木质素途径中,R材料CCo AOMT基因全部上调,上调的倍数大于感病材料;F5H基因在R和S材料中都表现为下调。CCo AOMT主要参与G型木质素单体的合成,而F5H参与S型木质素单体合成,表明G型木质素单体在抗病过程中起着重要作用。(5)结合全基因组关联分析,我们还找到21个基因在R或S材料中差异表达,包括4个功能未知基因,A8染色体上有8个,C6染色体上有13个;另外,在C6区间约330 kb处找到一个谷胱甘肽-s-转移酶基因簇上调约64倍。