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大蒜(Allium sativum L.)是重要的药食兼用蔬菜,在世界范围广泛栽培和食用。由于大蒜栽培种主要利用鳞茎进行无性繁殖,极易产生病毒积累,从而导致产量和品质下降。利用组织培养技术脱毒是大蒜品种提纯复壮的有效手段。然而大蒜试管苗培养过程中玻璃化现象严重,限制了这一技术在生产中的普遍应用。试管苗玻璃化是植物组织培养过程中普遍存在的一种生理障碍。玻璃化试管苗呈现半透明水浸状,其组织结构和生理功能异常,分化能力低下,难以成芽和增殖,也难以生根成苗,移栽后成活率低,后期生长差,对植物脱毒、快繁及基因遗传转化影响严重,但其发生机制至今尚未明确。研究发现,在试管苗玻璃化过程中同时存在活性氧物质(ROS)的产生和积累,更多的研究也证实试管苗玻璃化与活性氧代谢紊乱相关,但其相互关系及作用机理迄今少有报道。为了明确试管苗玻璃化过程中活性氧代谢特点,探究活性氧诱导试管苗玻璃化的生理和分子生物学机制,本研究以大蒜品种’二水早’为材料,采用组织观察、生理测定、高通量测序等技术,从组织-细胞-分子等不同层次,探讨活性氧与试管苗玻璃化、细胞器损伤、细胞膜异变和miRNAs及其靶基因表达的关系,进而揭示试管苗玻璃化的机理。主要研究结果如下:1.在培养基中添加不同浓度(0、0.5、1.0、1.5和2.0mM)外源H202,观察不同浓度下大蒜试管苗玻璃化发生差异及其生理特点。与其他浓度相比,1.5 mM H2O2作用下的试管苗玻璃化率最高。同时,1.5 mM H2O2处理使试管苗的组织含水量显著增加,叶绿素及可溶性蛋白含量显著降低。SDS-PAGE电泳结果显示,1.5 mM H2O2处理诱导试管苗产生了两条新的蛋白谱带,分子量分别为52 kD及110kD。同时,试管苗83 kD和105 kD的两条蛋白谱带表达量增强。2.在培养基中添加1.5mM H2O2,随着培养时间的延长,试管苗玻璃化率显著提高,玻璃化程度明显加重,叶绿体和线粒体结构发生损伤,亚细胞水平超氧阴离子产生速率(O2·-)和内源H2O2含量显著提高。与其他细胞器相比,质外体抗氧化系统响应胁迫最早,ROS产生和累积最显著,说明质外体在试管苗氧化胁迫和玻璃化发生过程中具有重要作用。3.利用外源H2O2和二碘基苯(DPI,NADPH氧化酶抑制剂)、叠氮化钠(NaN3,POD抑制剂)以及双辛胍胺(GUA,PAO抑制剂)处理大蒜试管苗,发现外源H2O2处理使试管苗质膜NADPH氧化酶、细胞壁POD及质外体PAO的活性均显著增加,而抑制NADPH氧化酶、POD及PAO活性能够显著降低氧化胁迫下试管苗玻璃化率、O2·-产生速率和H2O2含量,其中DPI对试管苗产生O2·-的抑制作用显著高于NaN3和GUA。在整个处理期间,外源H2O2使质膜NADPH氧化酶活性始终呈现上升趋势,而细胞壁POD及质外体PAO活性短暂提高后逐渐降低,说明质膜NADPH氧化酶是催化试管苗活性氧形成的重要氧化酶。4.采用半液体培养、培养基中添加高浓度6-BA和外源H2O2诱导玻璃化试管苗,研究玻璃化苗细胞壁及细胞膜在结构、组成及其功能的异常变化。结果发现,与正常试管苗相比,玻璃化苗细胞壁纤维素、木质素及果胶含量显著降低,细胞膜不饱和脂肪酸指数和磷脂含量显著降低;玻璃试管化苗细胞膜H+-ATPase活性、细胞膜流动性及细胞膜Ca2+含量显著低于正常试管苗。说明玻璃化试管苗细胞壁和细胞膜结构与物质组成发生异常变化,并由此导致其功能的异常。5.利用在培养基添加外源H2O2和不添加H2O2,构建氧化胁迫处理和正常培养(对照)2个小RNA文库,利用miRNAs测序技术,筛选和鉴定出大蒜试管苗响应氧化胁迫的353条保守miRNAs和76条新miRNAs,其中133条miRNAs在氧化胁迫下是显著上调表达,76条miRNAs显著下调表达。同时进行降解组测序和分析,发现21条保守mmiRNAs靶向26个靶基因家族,17条新miRNAs靶向3个基因家族。靶向蛋白质水解酶及乙烯转录因子的相关miRNAs上调表达,靶向ATP和膜蛋白基因的相关miRNAs下调表达。由此推测,差异表达miRNAs的靶基因主要在跨膜蛋白合成、能量代谢及乙烯响应等过程中起调控作用。