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漆酶2(laccase2, LAC2)是一种酚氧化酶,在醌鞣化过程中使表皮中的蛋白质与醌结合发生氧化反应,生成一些不溶于水的鞣化蛋白,从而形成一层可以阻挡外界生物伤害的十分坚硬的角质层,同时LAC2也参与了昆虫的免疫反应。本实验以“超级害虫”烟粉虱MEAM1隐种(以往称为“B型烟粉虱”)为研究对象,克隆得到烟粉虱LAC2基因的开放阅读框序列;并通过RT-qPCR技术,观测烟粉虱不同发育阶段与不同组织内LAC2基因表达的量;利用基于纳米载体的体壁渗透法干扰伪蛹的LAC2基因,研究LAC2在鞣化过程中的作用。研究结果如下:
1.烟粉虱LAC2基因的克隆及序列分析
本试验成功克隆出烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因的cDNA全长序列,长度2238bp,编码745个氨基酸残基(GenBank登录号:XM_019057634.1)。预测信号肽位于1-26位氨基酸(MKVKMSRSNG LFVVLVIGVC CEFVSS ),该蛋白预测分子量大小为82.53kD,等电点PI为6.31,属于稳定性蛋白;脂溶系数为83.44;蛋白的平均疏水性为-0.213。其分子式为C3682H5694N1024O1069S35;通过构建系统发育树研究发现烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因与半翅目黑尾叶蝉(Nephotettix bipunctatus)、点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)聚为一支,具有较近的亲缘关系,且同源性在90%以上。而烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因与烟粉虱LAC、LAC1、LAC4基因相距较远,说明烟粉虱LAC2基因与其他漆酶家族基因的功能不同。
2.烟粉虱LAC2基因时空表达分析
本研究对烟粉虱不同组织中的LAC2基因进行RT-qPCR分析,研究表明LAC2基因在烟粉虱MEAM1隐种成虫的不同组织中表达量差异很大,其中表皮内相对含量最高,因此判断LAC2可能参与成虫表皮的鞣化作用。通过RT-qPCR技术,检测烟粉虱LAC2在不同发育阶段的相对含量。结果表明,LAC2在不同的发育阶段均有所表达,但相对差异较大;在若虫期,随着龄期的增加LAC2基因的表达量均有所升高,在伪蛹期表达量最高,而成虫相对表达量较低。又通过观察伪蛹末期与初羽化成虫中LAC2基因表达量,发现即将羽化的烟粉虱伪蛹末期LAC2基因表达量是新羽化成虫LAC2基因表达量的三倍多。说明LAC2在若虫中表达量较高,主要参与若虫发育成伪蛹后伪蛹表皮的鞣化作用。
3.烟粉虱LAC2基因的生物学功能研究
本实验利用基于纳米载体的体壁渗透法沉默烟粉虱MEAM1隐种伪蛹期的LAC2基因,研究发现干扰成功的烟粉虱出现了伪蛹体表变软、逐渐干瘪无法抵抗外界环境而死亡的现象,同时干扰LAC2基因的伪蛹与对照组相比羽化时间延长2d,羽化率也显著下降。
综上所述,LAC2主要通过“醌鞣化”作用促进烟粉虱MEAM1隐种角质层的暗化与硬化反应,从而阻挡外界有害生物侵害。本研究获得烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因序列,并检测LAC2基因在烟粉虱中的表达模式和生理功能,为烟粉虱MEAM1隐种防治提供新思路、新途径。
1.烟粉虱LAC2基因的克隆及序列分析
本试验成功克隆出烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因的cDNA全长序列,长度2238bp,编码745个氨基酸残基(GenBank登录号:XM_019057634.1)。预测信号肽位于1-26位氨基酸(MKVKMSRSNG LFVVLVIGVC CEFVSS ),该蛋白预测分子量大小为82.53kD,等电点PI为6.31,属于稳定性蛋白;脂溶系数为83.44;蛋白的平均疏水性为-0.213。其分子式为C3682H5694N1024O1069S35;通过构建系统发育树研究发现烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因与半翅目黑尾叶蝉(Nephotettix bipunctatus)、点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)聚为一支,具有较近的亲缘关系,且同源性在90%以上。而烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因与烟粉虱LAC、LAC1、LAC4基因相距较远,说明烟粉虱LAC2基因与其他漆酶家族基因的功能不同。
2.烟粉虱LAC2基因时空表达分析
本研究对烟粉虱不同组织中的LAC2基因进行RT-qPCR分析,研究表明LAC2基因在烟粉虱MEAM1隐种成虫的不同组织中表达量差异很大,其中表皮内相对含量最高,因此判断LAC2可能参与成虫表皮的鞣化作用。通过RT-qPCR技术,检测烟粉虱LAC2在不同发育阶段的相对含量。结果表明,LAC2在不同的发育阶段均有所表达,但相对差异较大;在若虫期,随着龄期的增加LAC2基因的表达量均有所升高,在伪蛹期表达量最高,而成虫相对表达量较低。又通过观察伪蛹末期与初羽化成虫中LAC2基因表达量,发现即将羽化的烟粉虱伪蛹末期LAC2基因表达量是新羽化成虫LAC2基因表达量的三倍多。说明LAC2在若虫中表达量较高,主要参与若虫发育成伪蛹后伪蛹表皮的鞣化作用。
3.烟粉虱LAC2基因的生物学功能研究
本实验利用基于纳米载体的体壁渗透法沉默烟粉虱MEAM1隐种伪蛹期的LAC2基因,研究发现干扰成功的烟粉虱出现了伪蛹体表变软、逐渐干瘪无法抵抗外界环境而死亡的现象,同时干扰LAC2基因的伪蛹与对照组相比羽化时间延长2d,羽化率也显著下降。
综上所述,LAC2主要通过“醌鞣化”作用促进烟粉虱MEAM1隐种角质层的暗化与硬化反应,从而阻挡外界有害生物侵害。本研究获得烟粉虱MEAM1隐种LAC2基因序列,并检测LAC2基因在烟粉虱中的表达模式和生理功能,为烟粉虱MEAM1隐种防治提供新思路、新途径。