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弓首蛔虫病(Toxocariasis)主要是由犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)寄生于犬的小肠而引起的一种人兽共患寄生虫病。人和多种动物可通过摄入犬弓首蛔虫的感染性虫卵或者感染性幼虫而感染。T.canis的感染性幼虫在终末宿主的小肠内发育为成虫,在非特异性宿主体内不能发育为成虫,而是穿过肠壁并迁移到各种组织中,造成弓首蛔虫病。人感染后,幼虫移行到身体的各个器官和组织中,引起内脏幼虫移行症(visceral larva migrans,VLM)、眼睛幼虫移行症(ocular larve migrans,OLM)、神经弓首蛔虫病(neurological toxocariasis,NT)和隐性弓首蛔虫病(covert toxocariasis,CT),造成各组织和器官的损害,严重影响人类的健康。腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC转运蛋白)是一类以ATP为驱动能的跨膜糖蛋白,负责转运内源性和异源性的生物大分子及小分子化合物包括糖、氨基酸、多肽、细胞代谢产物、金属离子、和药物等。ABC转运蛋白在维持机体渗透压稳定、营养吸收、多药耐药、抗原加工、细胞分裂、孢子形成、繁殖等多种生物学过程中发挥重要作用。该蛋白已在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)等多种原虫和蠕虫中进行了广泛的研究,但是对犬弓首蛔虫ABC转运蛋白的研究还未见报道。本研究克隆了犬弓首蛔虫腺苷三磷酸结合盒G5基因(Tc-abcg-5基因),对犬弓首蛔虫腺苷三磷酸结合盒G5蛋白(TcABCG5)的组织分布情况进行了研究,并利用RNA干扰技术对Tc-abcg-5的功能进行了探讨,试验结果总结如下:1.Tc-abcg-5基因的克隆及序列分析本研究以T.canis总RNA为模板,克隆了Tc-abcg-5基因的完整编码区(coding sequence,CDS)序列并进行序列分析。结果显示Tc-abcg-5基因的序列长度为1902bp,预测编码633个氨基酸,编码蛋白质为TcABCG5,理论分子量为71.42 kDa,等电点为8.07。功能结构域分析显示,TcABCG5蛋白包含1个ABC转运蛋白结构域(第43-188位)和6个跨膜区(分别位于第350-372位,第387-409位,第422-453位,第468-490位,第497-514位,第600-622位)。亲疏水性分析表明,TcABCG5蛋白为疏水性蛋白。信号肽预测TcABCG5为非分泌型蛋白。多重序列分析表明TcABCG5的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)、猪蛔虫(Ascaris suum)、捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)、魏氏棘唇线虫(Acanthocheilonema viteae)和单一异尖线虫(Anisakis simplex)的ABCG5氨基酸序列在Walker A和Walker B模体处高度保守。系统发育分析表明Tc-abcg-5编码的氨基酸序列与猪蛔虫(A.suum)的ABCG5位于同一分支,其进化关系较近,与人(Homo sapiens)、牛(Bos taurus)、绵羊(Ovis aries)、白眉猴(Cercocebus atys)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、布氏鼠耳蝠(Myotis brandtii)等哺乳动物的进化关系较远。生物学功能预测显示,TcABCG5具有广泛的底物结合功能,参与内源性和异源性的生物大分子及小分子化合物的转运。2.TcABCG5的原核表达及多克隆抗体的制备本研究克隆了Tc-abcg-5基因的ABC转运蛋白结构域,构建了Tc-abcg-5/pET28a(+)原核表达载体,测序结果显示插入pET28a(+)载体中的序列长度为794 bp。重组质粒转化Transetta(DE3)大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞后,含有Tc-abcg-5/pET28a重组质粒的阳性菌在IPTG诱导下以包涵体形式表达TcABCG5重组蛋白,蛋白大小约为30 kDa。对诱导表达条件进行优化,最优的表达条件为0.8 mM的IPTG诱导,30℃培养12 h。通过镍离子亲和层析介质(Ni-NTA)对目的蛋白进行纯化,并用此蛋白制备了兔抗TcABCG5多克隆抗体。经检测,制备的多克隆抗体的浓度为0.86 mg/mL,抗体效价为1:512000左右,纯度在90%以上。蛋白质印记(Western Blot)显示制备的TcABCG5多克隆抗体与TcABCG5蛋白特异性结合,表明制备的兔抗TcABCG5多克隆抗体的特异性较好。3.Tc-abcg-5的差异表达及TcABCG5的组织定位研究采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对Tc-abcg-5在T.canis雌、雄虫以及雌虫各组织中的转录情况进行了分析。结果表明Tc-abcg-5基因在雌虫中的转录水平较高,特别是雌虫的生殖道中高量表达,而在肠道和体壁中的转录水平较低。采用间接荧光免疫组织化学技术(indirect fluorescence immunohistochemical analysis)对TcABCG5在雌、雄虫各组织中的分布情况进行了研究,结果显示TcABCG5主要分布在T.canis的生殖组织和肠道中,特别是在雌虫的卵巢、子宫和雄虫的储精囊中高表达,表明TcABCG5蛋白可能参与T.canis的生长、发育或繁殖等相关过程。4.Tc-abcg-5基因的RNA干扰研究采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术干扰T.canis成虫Tc-abcg-5基因的转录,利用qRT-PCR技术对Tc-abcg-5基因进行干扰后的分析。结果显示,干扰24 h、48 h后siRNA-744组Tc-abcg-5的相对表达量比siRNA-1024组和siRNA-466组显著性降低,表明siRNA-744有较高的沉默效率。随后采用电穿孔法和浸泡法对siRNA-744的递送效率进行比较,结果显示浸泡法更有利于将siRNA-744导入到T.canis虫卵内。用siRNA-744经浸泡法干扰T.canis感染性虫卵,经口灌服小鼠,感染后第七天对小鼠的肝脏、脑和肺脏组织进行病理学研究,结果显示RNA干扰使T.canis感染性虫卵的感染力下降,从而降低了肺脏、肝脏的病变程度,表明TcABCG5蛋白可能通过影响虫卵的发育从而参与T.canis的生长、发育过程。