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类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎症、全身性的自身免疫性疾病。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是信号转导体系网状结构中最重要的酶类之一,其在RA的病理机制及病程进展中起重要作用。MAPKs当前主要包含:细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)和p38MAP激酶(p38MAP kinases,p38MAPK)。栀子苷(Geniposide,GE)是从茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实中提取的抗炎活性成分。本课题组的前期研究证实:GE对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)有免疫调节作用,能够抑制AA大鼠外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocytes,PBL)和成纤维样滑膜细胞(Fibroblast like synoviocytes,FLS)增殖活性,修复肠系膜淋巴结淋巴细胞(Mesenteric lymph node lymphocytes,MLNL)增殖活性;降低炎性细胞因子(如白介素(interleukin,IL)-6、IL-17)的水平和提高抗炎细胞因子(如转录生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、IL-4)的水平;下调PBL和MLNL中JNK的磷酸化水平、MLNL中ERK1/2的磷酸化水平、PBL和FLS中p38MAPK的磷酸化水平。本实验基于课题组以往的研究,以免疫细胞(PBL)、外周免疫细胞(MLNL)、效应细胞(FLS)为研究对象,探讨GE整体给药如何影响这三种细胞中三条MAPKs亚型通路,并对这三条亚型通路进行相关性分析,找出三条通路间的交互作用。这对于阐明RA发病机理、GE的作用机制以及开发治疗RA疾病的新药具有重要的指导意义。目的:依据GE对AA大鼠的足爪肿胀、关节炎评分、肠系膜淋巴结和关节滑膜的病理形态学的改善作用,观察GE对大鼠AA的治疗作用;观察GE对AA大鼠PBL、MLNL和FLS细胞增殖反应的影响;观察GE对AA大鼠PBL、MLNL和FLS分泌炎性细胞因子和抗炎细胞因子水平的影响;观察GE对AA大鼠PBL、MLNL和FLS的MAPKs信号转导通路中ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平的影响,并分析这三条亚型通路的相关性,揭示三条通路间的交互作用。方法:大鼠足趾部皮下注射弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant,FCA)制备AA模型。造模成功的大鼠随机分为6组:正常组、模型组、GE(30,60,120 mg/kg)剂量组、青藤碱组(Sinomenine,SIN,90 mg/kg)。于继发性炎症反应出现后d14-d21,GE(30,60,120 mg/kg)和SIN(90 mg/kg)灌胃给药。足容积法测量继发侧足肿胀,并进行多发性关节炎评分;光学显微镜下观察肠系膜淋巴结及关节滑膜病理形态学变化;MTT法检测PBL、MLNL和FLS增殖活性;ELISA法检测PBL、MLNL和FLS培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-17和TGF-β水平;蛋白质电泳法(Western-blot)检测PBL、MLNL和FLS中MAPKs信号通路中ERK1/2、P-ERK1/2、JNK、P-JNK、p38、P-p38蛋白的表达量。结果:1 GE对AA大鼠的治疗作用造模后d14,AA组大鼠均出现全身症状,表现为四肢关节红肿、变形,行走不便,耳部及尾部结节,足爪肿胀度和关节炎指数明显升高(P<0.01);光镜下可见AA大鼠肠系膜淋巴结中有很多炎性细胞浸润,淋巴滤泡增生十分明显,皮质深层显著扩大;关节滑膜细胞增生明显,分布杂乱,滑膜下层纤维组织增生,血管扩张,伴有大量炎性细胞浸润。GE(60,120 mg/kg)治疗组经d14-d21灌胃给药后可显著抑制AA大鼠继发性足肿胀,降低关节炎指数(P<0.01),改善AA大鼠肠系膜淋巴结和关节滑膜炎症和病理变化。2 GE对AA大鼠PBL增殖能力、细胞因子分泌和MAPKs信号通路中关键蛋白表达的影响AA组大鼠的PBL增殖能力较正常组大鼠显著上升(P<0.01);与模型组相比,GE(60,120 mg/kg)给药组可明显抑制AA大鼠PBL增殖能力(P<0.01)。与正常大鼠相比,AA组大鼠PBL分泌的IFN-γ和IL-17水平明显增加(P<0.01),IL-4和TGF-β水平明显下降(P<0.01);与模型组比较,GE(60,120 mg/kg)给药组大鼠PBL分泌的IFN-γ和IL-17水平显著下降(P<0.01),IL-4和TGF-β水平明显升高(P<0.01),且呈剂量依赖的趋势。各组大鼠PBL中的ERK1/2、JNK和p38总蛋白的表达水平均未发生改变;与正常组相比,AA模型组P-ERK1/2、P-JNK和P-p38水平显著升高(P<0.01);GE(60,120 mg/kg)治疗组P-ERK1/2、P-JNK和P-p38水平较模型组均明显降低(P<0.01),且呈明显剂量依赖关系。3 GE对AA大鼠MLNL增殖能力、细胞因子分泌、MAPKs信号通路中关键蛋白表达和肠系膜淋巴结中MAPKs信号通路中关键蛋白表达的影响AA大鼠的MLNL增殖能力较正常大鼠显著下降(P<0.01);与模型组相比,GE(60,120 mg/kg)治疗组大鼠MLNL增殖能力明显升高(P<0.01),且呈明显剂量依赖关系。与正常大鼠相比,AA大鼠MLNL分泌的IFN-γ和IL-17水平显著升高(P<0.01),IL-4和TGF-β水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,GE(60,120 mg/kg)给药组大鼠MLNL分泌的IFN-γ和IL-17水平显著下降(P<0.01),IL-4和TGF-β水平明显增高(P<0.01),且呈剂量依赖的趋势,GE(30 mg/kg)给药组能显著降低AA大鼠MLNL分泌的IFN-γ,升高IL-4,但对IL-17和TGF-β无明显作用。各组大鼠MLNL和肠系膜淋巴结中的ERK1/2、JNK和p38总蛋白的表达水平均未发生改变;与正常大鼠相比,AA大鼠MLNL和肠系膜淋巴结中的P-ERK1/2、P-JNK和P-p38表达均显著升高(P<0.01);GE(60,120 mg/kg)可明显下调AA大鼠MLNL和肠系膜淋巴结中P-ERK1/2、P-JNK和P-p38的水平(P<0.01),且呈剂量依赖性下调关系。4 GE对AA大鼠FLS增殖能力、细胞因子分泌、MAPKs信号通路中关键蛋白表达和关节滑膜中MAPKs信号通路中关键蛋白表达的影响AA大鼠的FLS增殖能力较正常大鼠显著升高(P<0.01);与模型组相比,GE(60,120 mg/kg)给药组大鼠FLS增殖能力明显下降(P<0.01)。与正常大鼠相比,AA大鼠FLS分泌的IFN-γ和IL-17水平显著增加(P<0.01),IL-4和TGF-β水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,GE(60,120 mg/kg)给药组大鼠FLS分泌的IFN-γ和IL-17水平明显下降(P<0.01),IL-4和TGF-β水平明显升高(P<0.01),且呈剂量依赖的趋势,GE(30 mg/kg)给药组能显著升高AA大鼠FLS分泌的IL-4(P<0.05),但对IFN-γ、IL-17和TGF-β无明显作用。各组大鼠FLS和关节滑膜中的ERK1/2、JNK和p38总蛋白的表达水平均未发生变化;与正常大鼠相比,AA大鼠FLS和关节滑膜中的P-ERK1/2、P-JNK和P-p38的表达水平显著升高(P<0.01);GE(60,120 mg/kg)可明显下调AA大鼠FLS和关节滑膜中P-ERK1/2、P-JNK和P-p38的水平(P<0.01),且呈剂量依赖性下调关系。结论:1 GE(60,120 mg/kg)整体给药后,能显著降低AA大鼠继发侧关节肿胀和多发性关节炎指数;改善AA大鼠肠系膜淋巴结和关节滑膜的炎症和病理变化;抑制AA大鼠PBL和FLS过度增殖,修复MLNL低下的增殖活性。实验表明,GE缓解AA大鼠炎症反应与其调节AA大鼠细胞免疫密切相关。2 GE(60,120 mg/kg)治疗给药一方面下调AA大鼠PBL、MLNL和FLS分泌的炎性细胞因子IFN-γ和IL-17水平,上调抑炎细胞因子IL-4和TGF-β水平;一方面降低AA大鼠PBL、MLNL和FLS中ERK1/2、JNK、p38的过度磷酸化程度,抑制过度亢进的MAPKs信号,使被抑制的Th2和Treg细胞重新活化,抑制Th1和Th17细胞过度增殖,从而诱导Th1/Th2和Th17/Treg的免疫平衡,是GE发挥治疗作用的重要机制。