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随着第三代人工特异性核酸内切酶CRISPR/Cas9技术的发展和完善,基因组编辑在生命科学领域得到了广泛关注和应用。基因组编辑又称基因编辑,包括基因的定点敲除、敲入和点编辑等基因组操作。其中,点编辑是指对基因组特定位点引入点突变、少量碱基插入或缺失等微小突变的“精确编辑”。在哺乳动物细胞中,采用CRISPR/Cas9技术在基因组目标位点引入双链断裂(Double strand break,DSB)后,细胞主要通过非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)机制进行DSB的修复。然而,NHEJ修复具有“不可控性”,修复后在断口附近插入或缺失的碱基是随机的,尽管可以实现编码基因的移码敲除(2/3概率),但并不能实现基因组精确编辑。对于同源依赖性修复(Homology-directed repair,HDR)机制介导的DSB修复,通过供体DNA的重组效应能够实现有效的基因组定点敲入和精确编辑。近年来,基因组精确编辑在畜禽性状改良、基因功能研究以及畜禽动物模型的建立等方面受到了普遍重视。但是,基因组精确编辑依赖于CRISPR/Cas9打靶活性、HDR重组效应以及HDR供体选择等诸多因素,其效率尚有待进一步提高。本研究在前期实验室相关研究的基础上开发了新型ScRad52-Cas9基因组精确编辑系统,该系统成功的将酵母细胞中参与DNA断裂修复基因Rad52功能整合在CRISPR/Cas9系统中,期望提高哺乳动物细胞基因组精确编辑的效率。该系统首先在HEK293T细胞中进行了详细的功能验证,最后针对猪IGF2基因内含子3第3072位SNP进行了高效的G>A定点编辑,为以后的基因组精确编辑育种研究奠定了基础。本研究主要结果如下:1.设计并构建了两套HDR重组效率可视化检测报告系统:供体整合型和供体分离型HDR检测报告系统。将CRISPR/Cas9表达载体与HDR荧光报告载体(及供体DNA)共转染检测细胞(HEK293T)后,CRISPR/Cas9核酸酶打靶报告载体中目标位点,诱导eGFP报告基因通过HDR机制修复,进而通过荧光观察和流式细胞术分析(FACS)检测评估待测CRISPR/Cas9核酸酶介导HDR重组的效率。2.建立了基于酵母细胞参与DNA断裂修复基因Rad52(ScRad52)和Cas9共表达及融合表达策略的新型ScRad52-Cas9基因组精确编辑系统:采用上述HDR重组效率可视化检测报告系统的初步检测结果表明,ScRad52和Cas9共表达策略能够提高HDR效率2.8倍,而ScRad52和Cas9融合表达策略能够提高HDR效率3.4倍。3.采用上述ScRad52-Cas9基因组精确编辑系统,结合实验室前期开发的SSA-RPG基因编辑阳性细胞富集筛选技术,针对HEK293T细胞中VEGF和CCR5位点进行基因组精确编辑,初步的酶切分析结果表明ScRad52和Cas9共表达策略在VEGF位点和CCR5位点精确编辑效率为5.3%和11.9%,较对照组分别提高了2.8倍和2.2倍。另外,ScRad52-Cas9融合表达策略在上述两个位点的精确编辑效率为8.4%和14.7%,较对照组分别提高了3.7倍和3.2倍;测序分析结果表明:ScRad52-Cas9融合表达策略在VEGF和CCR5位点的精确编辑效率分别是对照组的3.3倍和3.8倍。进一步研究证明ScRad52-Cas9融合表达策略能够有效介导质粒供体、PCR产物供体和ssDNA供体等多种供体DNA形式的HDR重组。另外,Scr7抑制剂和ScRad52-Cas9策略具有协同效应,二者结合能够将HDR效率提高到40%左右。4.采用ScRad52-Cas9基因组精确编辑系统,针对猪IGF2基因内含子3中第3072位SNP进行了高效的G>A点编辑:在PK-15细胞中,ScRad52-Cas9融合表达策略介导的IGF2基因的编辑效率是对照组的2.2倍;在猪原代细胞中成功实现了IGF2基因的编辑,阳性率约为15.8%。