研究目的：　　研究PKG II抑制EGF引起的EGFR激活的作用机制，明确PKG II是否通过磷酸化EGFR的特异丝/苏氨酸位点而抑制其激活。同时研究重组PKG II蛋白对胃癌细胞增殖以及胃癌细胞移植瘤生长的影响，探讨PKG II作为分泌型蛋白激酶发挥作用的可能性。　　研究方法：　　（1）PKG II对EGF-EGFR结合抑制以及PKG II与EGFR的结合和对EGFR丝/苏氨酸磷酸化的检测：以腺病毒Ad-PKG II感染 COS-7细胞，并以8-pCPT-cGMP特异性激活PKG II，然后以EGF孵育处理细胞，采用激光共聚焦和流式分析的方法检测PKG II对EGF-EGFR结合的影响；IP和Western blotting方法检测PKG II对EGFR的丝/苏氨酸位点的磷酸化作用；Co-IP和双分子荧光互补实验检测细胞内PKG II与EGFR的结合。　　（2）PKG II与EGFR结合的相关结构域的确定：构建PKG II与EGFR不同域段的原核表达载体,经大肠杆菌表达后， pull-down法检测PKG II各缺失型突变体与EGFR的结合以及EGFR各缺失型突变体与PKG II的结合，分析PKG II与EGFR结合的具体域段。　　（3）PKG II对EGFR磷酸化位点的预测以及位点的确认和相关的验证：以磷酸化位点预测软件GPS2.0预测PKG II磷酸化 EGFR的特异性位点。Western blotting检测EGFR三个已知磷酸化位点（T654、S1046、T693）的磷酸化水平。位点突变法和Western blotting检测验证PKG II对EGFR的三个未知磷酸化位点（T406、T727、S945）的作用。EGFR突变体质粒转染后Co-IP检测PKGII对细胞内EGF和EGFR的结合的影响，IP和 Western Blotting方法检测EGFR（Y1068、Y1173）位点磷酸化水平。　　（4）细胞培养上清中PKG II以及重组PKG II抑制EGFR酪氨酸磷酸化的检测：以Ad-PKG II感染人胃癌细胞AGS和HGC-27，以及人胃上皮细胞GES-1，培养48 h后收集培养液上清，真空冷冻干燥，用Western Blotting检测培养上清中PKG II的含量。并通过Western blotting检测重组PKGII对EGF引起的细胞EGFR酪氨酸（Y1068）磷酸化的影响，以及重组PKG II对EGF引起的分离细胞膜中EGFR酪氨酸（Y1068和Y1173）磷酸化的影响。　　（5）重组PKG II对EGFR突变体的酪氨酸磷酸化以及对EGFR胞外段的丝/苏氨酸磷酸化作用的检测：以激活的重组PKG II蛋白作用表达位点突变型EGFR蛋白细胞的细胞膜，检测EGFR上Y1068和Y1173位点的磷酸化。以激活重组PKG II蛋白作用重组 His-EGFR(1-645aa)蛋白， Western blotting检测His-EGFR(1-645aa)的p-Thr/ser水平。　　（6）重组PKG II抑制胃癌细胞增殖、ERK和Akt激活以及移植瘤生长的检测：CCK8试剂盒检测重组PKG II对EGFR介导的细胞增殖活动的影响；Western blotting检测重组PKG II蛋白对EGF引起的ERK和Akt激活的影响；裸鼠致瘤实验检测重组PKGII对移植瘤生长的影响。　　研究结果：　　（1）在胃癌细胞中，PKG II与EGFR相互结合，使EGFR发生丝/苏氨酸磷酸化，进而抑制EGF与EGFR的结合以及EGF对EGFR的激活。　　（2）PKG II过其N端片段与EGFR结合，EGFR与PKG II结合的部位包括EGFR的胞外段和近膜结构域。　　（3）PKG II通过使 EGFR的T406和T693位点发生磷酸化，阻断EGF与EGFR的结合，从而抑制EGFR的激活和活性。　　（4）重组PKG II蛋白对胃癌细胞AGS和HGC-27的增殖以及对EGFR介导的信号通路关键蛋白的磷酸化/激活具有抑制作用。　　（5）重组PKG II蛋白对胃癌细胞移植瘤的生长有抑制作用。　　结论：　　（1）在胃癌细胞，PKG II可与EGFR结合并使EGFR的T406和T693位点发生磷酸化，从而抑制EGF对EGFR的激活和EGFR的活性。　　（2）重组PKG II蛋白抑制EGF刺激下的胃癌细胞增殖，并抑制胃癌细胞移植瘤的生长，提示PKG II可能作为分泌型蛋白激酶通过作用于细胞膜外的靶点而发挥作用。