基于适配体识别结合信号放大技术灵敏检测卡那霉素的研究

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由于抗生素在农牧业生产中的过度使用,其在食品中的负面影响受到了广泛的关注。因此,迫切需要开发一种快速便捷、高灵敏度、高选择性的检测复杂食品中抗生素的新方法。卡那霉素是一种常用的广谱氨基糖苷类抗生素,在农业、畜牧业和水产业中应用比较广泛,也常被添加到饲料中促进动物的生长发育,但残留在畜产品中的卡那霉素被人类长期食用后将会对人类健康产生巨大危害,如会导致耳毒性、肾毒性等副作用。我国、欧盟、美国FDA以及日本等许多国家和机构对卡那霉素在牛奶中的残留限量都作了明确规定。因此,设计出简单高效的适配体传感器,同时建立简便可行、快速准确的检测卡那霉素的方法对食品中抗生素的检测,保障食品安全和人类健康意义非常。本文以卡那霉素为检测目标,建立了基于适配体传感器的光学检测方法,实现了对卡那霉素的简便、灵敏、特异性检测,主要研究内容和结果可归纳为以下两个方面:一、基于适配体识别和切刻内切酶辅助信号放大方式对卡那霉素的比色法检测本研究设计了一种基于适配体生物识别和切刻内切酶辅助信号放大的比色检测卡那霉素的方法。设计发夹探针(Hairpin Probe,HP)的颈部为卡那霉素的适配体和与适配体互补的Extend DNA(E-DNA),而环部为开启后续循环反应的Target DNA(T-DNA)。标记着磁珠(Magnetic Bead,MB)和铂纳米颗粒(Nano Platinum,PtNPs)的MB-Pt ProbeDNA作为比色检测的信号探针,此信号探针上包含了切刻内切酶的识别序列和裂解位点并且可以和T-DNA进行部分互补杂交。在卡那霉素的存在时,由于卡那霉素与其适配体的高亲和力,HP会由亚稳态发夹形态向拉伸形态转变,从而促进了 T-DNA与信号探针的杂交,并开启后续的循环酶切反应。在切刻内切酶的作用下,信号探针被酶裂解从而释放另一端修饰着PtNPs的短链DNA。磁分离后,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine,TMB)和过氧化氢(Hydrogen Peroxide,H2O2)在循环酶切反应积累的大量游离的短链DNA上标记的PtNPs的催化下反应,从而溶液由无色变为明显的蓝色。该比色传感器对牛奶中的卡那霉素具有良好的选择性和敏感性,线性检测范围从0.5 pgmL-1到200ng·mL-1,检测限低至0.2pg·mL-1(S/N=3)。此外,通过调整相应的适配体序列,该方法可以应用到食品中其他抗生素残留的检测中。二、基于适配体识别结合DNA Walker信号放大对卡那霉素的荧光法检测本研究建立了一种利用适配体对目标物的特异性识别并结合DNAzyme驱动DNA walker信号放大方式检测卡那霉素的荧光分析方法,可用于牛奶实际样品中卡那霉素的检测。在本实验方案中,作为载体的磁珠与含有rA切割点(RNAA碱基)的 Complementary DNA(C-DNA)连接,其中荧光素(5-Carboxy fluorescein,FAM)和生物素分别被修饰在C-DNA的3’端和5’端。Aptamer为卡那霉素的适配体,其序列因与C-DNA部分互补从而被捕获在磁珠上。卡那霉素存在的情况下,可以与Aptamer DNA进行特异性结合,C-DNA被释放从而可以与walker DNA进行互补结合。加入Pb2+后,包含着具有Pb2+依赖型DNAzyme的walker DNA即可识别并切割在C-DNA上的rA切割位点,并将3,端标记FAM的DNA短链释放。随即触发walker DNA在磁珠表面自主运动,不断进行酶切反应,聚集大量游离的标记FAM的DNA短链,从而实现对FAM荧光信号的放大及信号分离过程,磁性分离后通过荧光信号的变化实现对卡那霉素定量检测。在优化条件下,从0.2 pg·mL-1到2 μg·mL-1的浓度范围内,卡那霉素浓度的对数值与体系的荧光强度呈良好的线性关系,检测限LOD为0.14 pg·mL-1(S/N=3)。此方法通过改变靶标的相应适配体序列还可以扩展到其他分析物的分析检测中,从而实施对食品安全性的监控。
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