【摘 要】
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酸性土壤约占世界潜在耕地的40%-50%,是制约粮食生产的主要限制因素。随着全球土壤酸化的加剧,铝毒和磷缺乏成为了酸性土壤上存在最为普遍的问题。在p H呈酸性的土壤中,铝离子的溶解度增加,一方面会对植物产生毒害,另一方面能够与磷酸盐络合,导致磷缺乏。许多研究已经证明,铝(Aluminum)可以刺激植物分泌有机酸,这个过程主要是由铝激活的苹果酸转运蛋白(Al-actived malate trans
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酸性土壤约占世界潜在耕地的40%-50%,是制约粮食生产的主要限制因素。随着全球土壤酸化的加剧,铝毒和磷缺乏成为了酸性土壤上存在最为普遍的问题。在p H呈酸性的土壤中,铝离子的溶解度增加,一方面会对植物产生毒害,另一方面能够与磷酸盐络合,导致磷缺乏。许多研究已经证明,铝(Aluminum)可以刺激植物分泌有机酸,这个过程主要是由铝激活的苹果酸转运蛋白(Al-actived malate transporter,ALMT)介导的苹果酸分泌和多种毒害物质外排蛋白(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)介导的柠檬酸分泌实现的。磷是植物生长发育必不可少的大量营养元素,当植物同时遭受铝毒且磷缺乏时,自身生长会受到明显抑制。因此,如何降低酸性土壤的铝毒害且提高有效磷含量成为一个重要的研究方向。本研究以甘蓝型油菜(Brassica napus)为主要研究材料,通过对131份油菜种质资源材料的茎部铝含量的测定,并结合基因组重测序数据开展全基因组关联分析(GWAS),我们鉴定出一个与油菜耐铝毒害相关的候选基因,Bna ALMT7.2(Gene ID:Bna A04g15700D)。随后,筛选出一对铝积累能力差异显著的油菜品种作为核心研究材料,然后在不同的铝胁迫和低磷胁迫条件下分析了这对油菜品种间的根生长速率、荧光染色、H+动力学等生理学差异和比较转录组学差异。随后,对包括Bna ALMT7.2在内的多个植物响应铝毒害相关的关键基因进行了实时荧光定量(q RT-PCR)分析。最后,通过对Bna ALMT7.2进行亚细胞定位,异源转基因植株的表型与功能分析等工作,阐明了Bna ALMT7.2在甘蓝型油菜耐受酸性条件下铝毒害的分子机制以及磷所起到的调节功能。主要结果如下:(1)油菜品种的筛选,鉴定及生理实验测定。本研究中共测量了131份油菜核心种质资源材料的茎秆的铝元素含量,结合已完成的全基因组重测序数据,通过全基因组关联分析(GWAS)发现一个显著性的关联区间,在此区间中,鉴定到一个可能参与油菜耐受铝胁迫的功能蛋白Bna ALMT7.2。随后,拟开展基于Bna ALMT7.2功能相关的油菜耐受铝毒害分子机制的深入研究工作。(2)从已有的131份油菜核心种质资源材料中筛选出一对铝耐受型和铝敏感型油菜品种,分别命名为铝敏感型(Al-S)和铝耐受型(Al-T)。为了研究油菜在不同磷浓度条件下耐受铝毒害的差异,本研究设计了四组试验处理条件(标注为:+P-Al,+P+Al,-P-Al,-P+Al)。随后,分别测定所筛选品种幼苗期的根生长速率,根系铝积累量及根尖H+动力学变化特征。结果表明,Al-T品种的根系生长速率较Al-S更快,根长较长,根系积累的铝浓度较高,且Al-T型油菜品种具有更强的耐受低磷胁迫的能力。(3)不同铝耐受型油菜品种的分子水平分析。本研究针对Al-T和Al-S这对铝耐受差异品种的根系进行了上述四个处理之后,将四组处理条件下的油菜根系幼苗进行分段取样,分别分为0-2cm,2-4cm,>4cm。随后,分别对不同区段的样品分别进行转录组学分析和荧光定量PCR(q RT-PCR)检测分析。通过对差异表达基因(DEGs)的分析,发现铝处理后与细胞壁相关的一些酶发生变化,如木葡聚糖内转葡萄糖激酶和果胶酶,另外抗氧化酶系统相关酶类也发生了明显变化。通过对DEGs的GO富集分析发现,Al-S主要集中于植物体内一些抗氧化酶活性,Al-T则集中于细胞壁酶,如木糖基转移酶和葡糖转移酶。通过对DEGs的KEGG富集发现,Al-S富集通路主要为初生代谢物,而Al-T为次生代谢物。随后通过对上述三段根中与铝相关的关键基因的定量分析,发现Bna ALMT7.2,Bna ALMT1.1和Bna ALS3.1这三个基因均在油菜根尖0-2cm处表达量最高,随着根系越往上表达量逐渐降低。在铝胁迫条件下,油菜敏感型Al-S中这三个基因的表达量要显著高于其在Al-T型品种的表达量。(4)Bna ALMT7.2的序列分析及其在油菜耐受铝毒害过程中的分子机制。通过系统发育树分析表明油菜ALMT家族共有34个成员,其中Bna ALMT7共有3成员。为了阐明Bna ALMT7.2的功能,本研究将其分别转化入拟南芥的野生型Col-0和苹果酸运输缺失突变体atalmt1中,得到两个过表达株系(Bna ALMT7.2/Col-0,OX-1,OX-2)和一个功能回复株系(Bna ALMT7.2/atalmt1,CO)。通过不同的磷铝处理发现,在缺磷条件下拟南芥根系生长整体降低,在铝胁迫条件下,两个过表达株系的根长均比野生型长,而回复株系的根长与野生型相差不多,表明Bna ALMT7.2在拟南芥中具有抗铝功能。
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