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【目的】
1.探讨miR-1307-5p在肺腺癌发生发展中的作用。
2.探究在肺腺癌中miR-1307-5p对TRAF3靶向调控作用。
3.miR-1307-5p在炎症和肺腺癌之间所发挥的生物学功能及机制。
【方法】
通过原位杂交实验对肺腺癌组织芯片(180点，90例肺腺癌组织，90例癌旁组织；随访时间2012年～2017年)分析病理标本中的miR-1307-5p与临床病理特征的相关性及qRCR检测miR-1307-5p在肺腺癌组织(15例)与细胞的表达差异。CCK-8、EDU和平板克隆检测转染mimic或inhibitor后A549和H1299肺腺癌细胞生长、增殖能力。划痕实验和Transwell检测转染mimic或inhibitor后A549和H1299肺腺癌细胞的迁移能力。生物信息学预测潜在的靶基因，双荧光素酶、Westernblot、QPCR验证miR-1307-5P靶向结合TRAF3。Westernblot、QPCR检测TRAF3在A549和H1299肺腺癌细胞系的表达水平。Westernblot检测miR-1307-5P靶向结合TRAF3对NF-κB/MAPK通路(P65、P-P65、P38、P-P38、ERK1/2、P-ERK1/2)中蛋白的表达水平。免疫荧光实验检测TRAF3与P65是否存在共定位及各处理组间的表达差异。构建慢病毒稳转株，通过体内裸鼠皮下成瘤实验亦观察LV-miR-1307-5p组、LV-NC组、LV-miR-1307-5p-inhibitor组在体内生长的情况。免疫组织化学法检测裸鼠皮下移植瘤中TRAF3蛋白的表达变化。
【结果】
1.miR-1307-5p在肺腺癌组织中上调
原位杂交实验(组织芯片180点，90例肺腺癌组织，90例癌旁组织；随访时间2012年～2017年)：miR-1307-5p在肺腺癌组织中呈高表达(P=0.002)；miR-1307-5p与患者肿瘤大小(T分期)(P=0.027)密切相关，与患者的年龄、性别、病理类型、病理分期、淋巴结转移(N分期)、远处转移(M分期)和临床分期没有相关性。在肺腺癌组织病理分析中，miR-1307-5p低表达患者更有利于预后(P=0.0146)。
QPCR实验：在正常的人支气管上皮细胞(16HBE)和2个肺腺癌细胞系(A549、H1299)中评估了miR-1307-5p，肺腺癌细胞中miR-1307-5p的表达水平较正常16HBE明显上调(P＜0.05)。实时荧光定量PCR检测到的miR-1307-5p表达水平表明，与肺腺癌癌旁组织相比，miR-1307-5p在大多数肺腺癌组织中显著上调(P＜0.01)。
2.miR-1307-5p促进肺腺癌细胞的增殖
CCK-8：通过CCK-8分析进一步研究了miR-1307-5p过表达或下调对肺腺癌细胞增殖的影响。数据显示，miR-1307-5p过表达的肺腺癌细胞的吸光度显着高于对照组(P＜0.05)。相反，与对照组相比，敲低miR-1307-5p导致肺腺癌细胞增殖下调(P＜0.05)。
EDU细胞增殖实验：使用miR-1307-5pmimic转染的肺腺癌细胞增殖率明显高于对照组(P＜0.01)；使用miR-1307-5pinhibitor转染的肺腺癌细胞增殖率低于对照组(P＜0.05)。
平板克隆实验：miR-1307-5p过表达组的肺腺癌细胞克隆增殖率明显高于对照组；miR-1307-5p抑制组的肺腺癌细胞克隆增殖率低于对照组(P＜0.01)。
3.miR-1307-5p促进细胞的迁移
Transwell：mimic组与对照组相比，miR-1307-5p促进肺腺癌细胞的迁移(P＜0.01)；inhibitor组和对照组相比，miR-1307-5p下调会相对抑制肺腺癌细胞的迁移(P＜0.01)。
划痕实验：mimic组与对照组相比，miR-1307-5p促进肺腺癌细胞的迁移(P＜0.05)；inhibitor组和对照组相比，miR-1307-5p下调会相对抑制肺腺癌细胞的迁移(P＜0.05)。
4.TRAF3是肺腺癌细胞中miR-1307-5p的靶基因
生物信息学软件：预测TRAF3是miR-1307-5p潜在的靶基因。
双荧光素酶实验：NC、mimic和inhibitor对靶基因突变载体和空载的活性没影响；mimic对于靶基因野生型载体的活性有明显抑制作用(P＜0.01)，inhibitor处理后，靶基因野生型载体的活性有一定提高(P＜0.05)；突变位点之后，mimic对于突变靶基因载体没有抑制作用，而inhibitor处理后，对于突变载体的活性也没有影响。
WesternBlot：mimic组与对照组相比，TRAF3的蛋白表达下调(P＜0.01)inhibitor组与对照组相比，TRAF3的蛋白表达上调(P＜0.01)。在正常的人支气管上皮细胞(16HBE)和2个肺腺癌细胞系(A549、H1299)中检测TRAF3蛋白表达水平，肺腺癌细胞中TRAF3的蛋白表达水平较正常16HBE明显下调(P＜0.05)。
QPCR：mimic组与对照组相比，TRAF3的mRNA水平表达下调(P＜0.01)inhibitor组与对照组相比，TRAF3的mRNA水平表达上调(P＜0.05)。在正常的人支气管上皮细胞(16HBE)和2个肺腺癌细胞系(A549、H1299)中检测TRAF3mRNA表达水平，肺腺癌细胞中TRAF3的mRNA表达水平较正常16HBE明显下调(P＜0.05)。
结果表明，miR-1307-5p可以直接结合TRAF3mRNA的3UTR。
5.miR-1307-5p靶向TRAF3调控NF-κB/MAPK通路
WesternBlot：mimic组与对照组相比，p-p65蛋白水平显著上调(P＜0.01)，inhibitor组与对照组相比，p-p65显著下调(P＜0.05)。结果表明miR-1307-5p靶向TRAF3激活NF-κB通路。mimic组与对照组相比，p-ERK1/2、p-p38蛋白水平显著上调(P＜0.01)，inhibitor组与对照组相比，p-ERK1/2、p-p38蛋白水平显著下调(P＜0.01)。结果表明miR-1307-5p靶向TRAF3上调MAPK通路。
细胞免疫荧光实验：TRAF3呈红色荧光，p65呈绿色荧光，核呈蓝色荧光，p65和TRAF3共定位现象显著，与对照组相比，mimic组的肺腺癌细胞中红色荧光相对减少，TRAF3在胞浆中表达，绿色荧光增多，p65在胞浆及部分核中均有表达，呈部分入核状态；反之，inhibitor组中红色荧光相对增多，TRAF3在胞浆和部分核中均有表达，绿色荧光减少，p65仅在胞浆有部分表达。
6.miR-1307-5p慢病毒稳转株各处理组的表达差异
QPCR：分别构建了过表达、抑制、阴性对照慢病毒稳转株，进行qPCR检查miR-1307-5p的表达。与miR-1307-5p过表达组相比，发现miR-1307-5p表达显着增加(P＜0.05)，而miR-1307-5p抑制组降低miR-1307-5p表达(P＜0.05)。
CCK-8：miR-1307-5p过表达的肺腺癌稳转株的吸光度显着高于阴性对照组；相反，与阴性对照组相比，miR-1307-5p抑制的肺腺癌稳转株导致肺腺癌细胞增殖下调(P＜0.01)。这些结果表明，miR-1307-5p在调节肺腺癌细胞增殖中具有促进作用。
7.miR-1307-5p裸鼠皮下移植瘤及移植瘤TRAF3蛋白的影响
裸鼠皮下成瘤实验：过表达miR-1307-5p之后，A549和H1299在体内成瘤能力明显增加，成瘤的体积比对照组大，具有统计学显著差异(P＜0.05)；抑制miR-1307-5p之后，A549和H1299在体内成瘤能力明显减弱，成瘤的体积比对照组小，具有统计学显著差异(P＜0.05)。过表达miR-1307-5p组肿瘤重量明显高于对照组(P＜0.05)，抑制miR-1307-5p组肿瘤重量明显低于对照组(P＜0.05)，差异具有统计学意义。
免疫组织化学实验：与阴性对照组相比，过表达组移植瘤中TRAF3蛋白在胞浆内的着色程度减弱，着色细胞的数目均明显减少；抑制组移植瘤在胞浆内的着色程度增强、着色细胞的数目均明显增加。与之前的细胞体外实验一致，说明miR-1307-5p在体内促进肺腺癌细胞的增殖并与TRAF3相结合。
【结论】
1.在新鲜组织样本中，与肺腺癌癌旁组织对照，miR-1307-5p的表达水平升高；在临床随访样本中，miR-1307-5p的表达水平升高与肺腺癌患者的总体生存率降低显着相关；与人支气管上皮样细胞16HBE对照，miR-1307-5p在A549和H1299肺腺癌中呈高表达。
2.miR-1307-5p促进A549和H1299肺腺癌细胞的增殖和迁移。
3.通过体内外实验，miR-1307-5P靶向结合TRAF3调控NF-κB/MAPK通路促进肺腺癌的增殖。MAPK/NF-κB通路。
1.探讨miR-1307-5p在肺腺癌发生发展中的作用。
2.探究在肺腺癌中miR-1307-5p对TRAF3靶向调控作用。
3.miR-1307-5p在炎症和肺腺癌之间所发挥的生物学功能及机制。
【方法】
通过原位杂交实验对肺腺癌组织芯片(180点，90例肺腺癌组织，90例癌旁组织；随访时间2012年～2017年)分析病理标本中的miR-1307-5p与临床病理特征的相关性及qRCR检测miR-1307-5p在肺腺癌组织(15例)与细胞的表达差异。CCK-8、EDU和平板克隆检测转染mimic或inhibitor后A549和H1299肺腺癌细胞生长、增殖能力。划痕实验和Transwell检测转染mimic或inhibitor后A549和H1299肺腺癌细胞的迁移能力。生物信息学预测潜在的靶基因，双荧光素酶、Westernblot、QPCR验证miR-1307-5P靶向结合TRAF3。Westernblot、QPCR检测TRAF3在A549和H1299肺腺癌细胞系的表达水平。Westernblot检测miR-1307-5P靶向结合TRAF3对NF-κB/MAPK通路(P65、P-P65、P38、P-P38、ERK1/2、P-ERK1/2)中蛋白的表达水平。免疫荧光实验检测TRAF3与P65是否存在共定位及各处理组间的表达差异。构建慢病毒稳转株，通过体内裸鼠皮下成瘤实验亦观察LV-miR-1307-5p组、LV-NC组、LV-miR-1307-5p-inhibitor组在体内生长的情况。免疫组织化学法检测裸鼠皮下移植瘤中TRAF3蛋白的表达变化。
【结果】
1.miR-1307-5p在肺腺癌组织中上调
原位杂交实验(组织芯片180点，90例肺腺癌组织，90例癌旁组织；随访时间2012年～2017年)：miR-1307-5p在肺腺癌组织中呈高表达(P=0.002)；miR-1307-5p与患者肿瘤大小(T分期)(P=0.027)密切相关，与患者的年龄、性别、病理类型、病理分期、淋巴结转移(N分期)、远处转移(M分期)和临床分期没有相关性。在肺腺癌组织病理分析中，miR-1307-5p低表达患者更有利于预后(P=0.0146)。
QPCR实验：在正常的人支气管上皮细胞(16HBE)和2个肺腺癌细胞系(A549、H1299)中评估了miR-1307-5p，肺腺癌细胞中miR-1307-5p的表达水平较正常16HBE明显上调(P＜0.05)。实时荧光定量PCR检测到的miR-1307-5p表达水平表明，与肺腺癌癌旁组织相比，miR-1307-5p在大多数肺腺癌组织中显著上调(P＜0.01)。
2.miR-1307-5p促进肺腺癌细胞的增殖
CCK-8：通过CCK-8分析进一步研究了miR-1307-5p过表达或下调对肺腺癌细胞增殖的影响。数据显示，miR-1307-5p过表达的肺腺癌细胞的吸光度显着高于对照组(P＜0.05)。相反，与对照组相比，敲低miR-1307-5p导致肺腺癌细胞增殖下调(P＜0.05)。
EDU细胞增殖实验：使用miR-1307-5pmimic转染的肺腺癌细胞增殖率明显高于对照组(P＜0.01)；使用miR-1307-5pinhibitor转染的肺腺癌细胞增殖率低于对照组(P＜0.05)。
平板克隆实验：miR-1307-5p过表达组的肺腺癌细胞克隆增殖率明显高于对照组；miR-1307-5p抑制组的肺腺癌细胞克隆增殖率低于对照组(P＜0.01)。
3.miR-1307-5p促进细胞的迁移
Transwell：mimic组与对照组相比，miR-1307-5p促进肺腺癌细胞的迁移(P＜0.01)；inhibitor组和对照组相比，miR-1307-5p下调会相对抑制肺腺癌细胞的迁移(P＜0.01)。
划痕实验：mimic组与对照组相比，miR-1307-5p促进肺腺癌细胞的迁移(P＜0.05)；inhibitor组和对照组相比，miR-1307-5p下调会相对抑制肺腺癌细胞的迁移(P＜0.05)。
4.TRAF3是肺腺癌细胞中miR-1307-5p的靶基因
生物信息学软件：预测TRAF3是miR-1307-5p潜在的靶基因。
双荧光素酶实验：NC、mimic和inhibitor对靶基因突变载体和空载的活性没影响；mimic对于靶基因野生型载体的活性有明显抑制作用(P＜0.01)，inhibitor处理后，靶基因野生型载体的活性有一定提高(P＜0.05)；突变位点之后，mimic对于突变靶基因载体没有抑制作用，而inhibitor处理后，对于突变载体的活性也没有影响。
WesternBlot：mimic组与对照组相比，TRAF3的蛋白表达下调(P＜0.01)inhibitor组与对照组相比，TRAF3的蛋白表达上调(P＜0.01)。在正常的人支气管上皮细胞(16HBE)和2个肺腺癌细胞系(A549、H1299)中检测TRAF3蛋白表达水平，肺腺癌细胞中TRAF3的蛋白表达水平较正常16HBE明显下调(P＜0.05)。
QPCR：mimic组与对照组相比，TRAF3的mRNA水平表达下调(P＜0.01)inhibitor组与对照组相比，TRAF3的mRNA水平表达上调(P＜0.05)。在正常的人支气管上皮细胞(16HBE)和2个肺腺癌细胞系(A549、H1299)中检测TRAF3mRNA表达水平，肺腺癌细胞中TRAF3的mRNA表达水平较正常16HBE明显下调(P＜0.05)。
结果表明，miR-1307-5p可以直接结合TRAF3mRNA的3UTR。
5.miR-1307-5p靶向TRAF3调控NF-κB/MAPK通路
WesternBlot：mimic组与对照组相比，p-p65蛋白水平显著上调(P＜0.01)，inhibitor组与对照组相比，p-p65显著下调(P＜0.05)。结果表明miR-1307-5p靶向TRAF3激活NF-κB通路。mimic组与对照组相比，p-ERK1/2、p-p38蛋白水平显著上调(P＜0.01)，inhibitor组与对照组相比，p-ERK1/2、p-p38蛋白水平显著下调(P＜0.01)。结果表明miR-1307-5p靶向TRAF3上调MAPK通路。
细胞免疫荧光实验：TRAF3呈红色荧光，p65呈绿色荧光，核呈蓝色荧光，p65和TRAF3共定位现象显著，与对照组相比，mimic组的肺腺癌细胞中红色荧光相对减少，TRAF3在胞浆中表达，绿色荧光增多，p65在胞浆及部分核中均有表达，呈部分入核状态；反之，inhibitor组中红色荧光相对增多，TRAF3在胞浆和部分核中均有表达，绿色荧光减少，p65仅在胞浆有部分表达。
6.miR-1307-5p慢病毒稳转株各处理组的表达差异
QPCR：分别构建了过表达、抑制、阴性对照慢病毒稳转株，进行qPCR检查miR-1307-5p的表达。与miR-1307-5p过表达组相比，发现miR-1307-5p表达显着增加(P＜0.05)，而miR-1307-5p抑制组降低miR-1307-5p表达(P＜0.05)。
CCK-8：miR-1307-5p过表达的肺腺癌稳转株的吸光度显着高于阴性对照组；相反，与阴性对照组相比，miR-1307-5p抑制的肺腺癌稳转株导致肺腺癌细胞增殖下调(P＜0.01)。这些结果表明，miR-1307-5p在调节肺腺癌细胞增殖中具有促进作用。
7.miR-1307-5p裸鼠皮下移植瘤及移植瘤TRAF3蛋白的影响
裸鼠皮下成瘤实验：过表达miR-1307-5p之后，A549和H1299在体内成瘤能力明显增加，成瘤的体积比对照组大，具有统计学显著差异(P＜0.05)；抑制miR-1307-5p之后，A549和H1299在体内成瘤能力明显减弱，成瘤的体积比对照组小，具有统计学显著差异(P＜0.05)。过表达miR-1307-5p组肿瘤重量明显高于对照组(P＜0.05)，抑制miR-1307-5p组肿瘤重量明显低于对照组(P＜0.05)，差异具有统计学意义。
免疫组织化学实验：与阴性对照组相比，过表达组移植瘤中TRAF3蛋白在胞浆内的着色程度减弱，着色细胞的数目均明显减少；抑制组移植瘤在胞浆内的着色程度增强、着色细胞的数目均明显增加。与之前的细胞体外实验一致，说明miR-1307-5p在体内促进肺腺癌细胞的增殖并与TRAF3相结合。
【结论】
1.在新鲜组织样本中，与肺腺癌癌旁组织对照，miR-1307-5p的表达水平升高；在临床随访样本中，miR-1307-5p的表达水平升高与肺腺癌患者的总体生存率降低显着相关；与人支气管上皮样细胞16HBE对照，miR-1307-5p在A549和H1299肺腺癌中呈高表达。
2.miR-1307-5p促进A549和H1299肺腺癌细胞的增殖和迁移。
3.通过体内外实验，miR-1307-5P靶向结合TRAF3调控NF-κB/MAPK通路促进肺腺癌的增殖。MAPK/NF-κB通路。