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高原红细胞增多症(HAPC)是一种高原常见的慢性疾病,以红细胞过度增多为特点,严重影响着高原居民的身体健康。其发病原因是由高原低氧引起的,但发病机制尚未阐明。GATA-1作为红系分化核心转录调控因子,对红系分化至关重要。GATA-1可调控红系特异性miR-451a,参与到红系分化的进程中。GATA-1的表达受低氧调控,但低氧下GATA-1是否调控miR-451a参与红细胞增多尚未可知。本研究以K562细胞和HAPC患者CD34~+造血干/祖细胞为研究对象,从体外细胞模型研究到临床样本两方面,探讨低氧下GATA-1和miR-451a在红系分化中的相关性。内容包括两部分,分述如下:第一部分低氧下K562细胞向红系分化进程中GATA-1与miR-451a表达的相关性研究目的:探讨低氧下K562细胞向红系分化进程中GATA-1与微小RNA-451a(micro RNA-451a,miR-451a)表达的相关性。方法:K562细胞分为常氧组和低氧组(1%O2),经40μM氯化血红素(hemin)分别诱导分化至48 h、72 h,检测γ-globin、CD235a红系分化指标表达,验证K562细胞红系分化模型是否复制成功。在K562细胞向红系分化的不同时间点,Western blot检测两组GATA-1的蛋白表达情况;采用q RT-PCR检测两组GATA-1和miR-451a的RNA表达水平并做相关性分析。检测K562细胞GATA-1过表达组、抑制组和阴性病毒对照组的红系分化指标,同时采用瑞氏-吉姆萨染色方法分析上述组别的细胞形态学变化,明确GATA-1过表达和抑制后K562细胞向红系分化情况。q RT-PCR检测GATA-1过表达和抑制后miR-451a表达变化。结果:两组分化不同时间点的γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率和CD235a表达量均显著高于0 h(P<0.01)。低氧组72 h的γ-globin、联苯胺染色阳性率和CD235a表达量均显著高于常氧组(P<0.05)。低氧组GATA-1和miR-451a的表达随红系分化过程均呈现上升趋势(P<0.05),并在72 h均显著高于常氧组(P<0.05)。相关性分析结果显示,低氧下GATA-1与miR-451a的表达呈正相关(P<0.01)。GATA-1慢病毒转染K562细胞后,低氧下72 h过表达组γ-globin、联苯胺染色阳性率、CD235a及细胞体积增大、核偏移和核缩小细胞数均显著高于阴性对照组(P<0.05);72 h抑制组γ-globin、联苯胺染色阳性率、CD235a及细胞体积增大、核偏移和核缩小细胞数均显著低于阴性对照组(P<0.05)。与阴性对照组相比,低氧下过表达GATA-1后,72 h时miR-451a的表达显著增高(P<0.05);抑制GATA-1后,72 h时miR-451a的表达显著降低(P<0.05)。结论:低氧诱导GATA-1表达增高进而上调miR-451a促进K562细胞向红系分化。第二部分HAPC患者有核红细胞GATA-1与miR-451a表达的相关性研究目的:尽管慢性缺氧是引发HAPC发病的主要原因,但其相关的分子机制尚未清楚。本研究初步探讨GATA-1与miR-451a在HAPC患者有核红细胞中的表达,并进行相关性分析,为HAPC的机制提供实验数据。方法:抽取10例确诊为HAPC患者和10例健康者的外周血分别作为HAPC组和Control组,采用免疫磁珠法分别分离两组外周血CD34~+细胞、CD71~+细胞和CD235a~+细胞。(1)q RT-PCR检测CD71~+、CD235a~+细胞内GATA-1与miR-451a表达变化。(2)两组分离得到的CD34~+细胞分别在常氧和低氧(1%O2)下培养,采用无血清培养体系将CD34~+细胞向红系特异性诱导。诱导体系内添加Erythroid Expansion Supplement补加因子,分别诱导至7 D、11 D和15 D。q RT-PCR检测γ-globin表达,同时采用瑞氏-吉姆萨染色方法分析细胞形态变化,验证CD34~+细胞红系分化模型是否建立成功;(3)CD34~+细胞半固体克隆培养检测细胞增殖能力;(4)流式检测CD34~+细胞在诱导15 D后CD235a的表达;(5)采用q RT-PCR检测GATA-1和miR-451a的RNA表达水平并做相关性分析。结果:(1)HAPC组GATA-1 m RNA在CD71~+、CD235a~+有核红细胞内表达显著低于对照组(P<0.01),HAPC组miR-451a表达显著高于对照组(P<0.01);(2)Control组γ-globin的表达分别在常氧、低氧下均呈上升趋势(P<0.01),且在各时间点低氧下γ-globin的表达显著高于常氧下的表达(P<0.01);HAPC组γ-globin的表达在低氧下呈逐渐增高(P<0.01),且在各时间点低氧下γ-globin的表达显著高于常氧下的表达(P<0.01);Control组在常氧和低氧下,其核偏移、核缩小以及核浆比减少的细胞数均呈现上升趋势(P<0.05);HAPC组在常氧和低氧下核偏移、核缩小以及核浆比减少的细胞数均呈现上升趋势(P<0.05)。以上结果说明,该方法诱导CD34~+细胞向红系分化是可行的;(3)第一天HAPC组在常氧和低氧下均出现BFU-E和CFU-E集落,但Control组在常氧和低氧下均未出现BFU-E和CFU-E集落。HAPC组与Control组BFU-E集落形成数量在7 D、11 D和15 D均无显著差异(P>0.05)。HAPC组在各时间点CFU-E集落数量均显著高于Control组(P<0.05);(4)HAPC组CD235a的表达在常氧和低氧下均显著高于对照组(P<0.05);(5)常氧下,HAPC组在第15 D时GATA-1的m RNA表达显著高于Control组的表达(P<0.01);低氧下,HAPC组GATA-1的m RNA表达在第11 D、15 D时显著低于Control组(P<0.05);常氧下,HAPC在7 D、15D时miR-451a的表达显著高于Control组(P<0.01);低氧下,HAPC组在11D、15D时miR-451a的表达显著高于Control组(P<0.01);相关性分析显示,HAPC组在低氧下GATA-1与miR-451a的表达呈负相关,r=-0.704(P=0.001)。结论:HAPC红细胞增多可能是通过增加CFU-E的数目实现的;HAPC患者红系分化进程加快;HAPC患者外周血CD34~+造血干/祖细胞在低氧下向红系分化过程中,GATA-1与miR-451a异常表达,其调控关系可能是高原红细胞增多症的发病机制之一。