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FOXO在动物的生长发育、细胞分化、代谢凋亡、信号转导等方面有多种重要的生物功能。在哺乳动物中，胰岛素样生长因子IGF/PI3K/FOXO信号转导通路与细胞分裂周期、死亡、应激、解毒等不同的细胞进程有关。家蚕（Bombyx mori）幼虫至蛹变态期间发生着激烈的新旧组织更迭，其中包括幼虫专性组织丝腺等迅速退化消亡。家蚕FOXO是否可能涉及家蚕特定组织状态的细胞分化与凋亡调控，目前尚未有相关研究。为此，本文以家蚕幼虫到蛹变态期自发的和诱导的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）为切入点，克隆了家蚕FOXO全长基因，调查了Foxo基因的表达谱，并通过蜕皮激素及限食与饥饿处理，调查了个体丝腺组织和BmN细胞中Foxo基因及其上下游信号转导途径相关基因表达变化情况，以及某些情况下丝腺中FOXO蛋白表达变化情况，从而希望能够对家蚕变态发育期PCD发生的分子调控机制研究提供参考。获得的主要结果如下：1家蚕Foxo基因的克隆与鉴定通过对实验室已有的Foxo基因部分序列进行拼接验证，利用RACE技术克隆出家蚕Foxo基因全长mRNA序列，长3326bp，最长ORF为1539bp。Foxo基因由9个外显子和8个内含子组成，定位于家蚕9号染色体的nscaf2890上，编码512个氨基酸，理论推测蛋白分子量55679.76，等电点6.08。FOXO蛋白在402434氨基酸区域有2个由内到外和1个由外到内的跨膜螺旋。二级结构预测，FOXO蛋白α螺旋约占33.01%，延伸链约占7.81%，β转角约占3.21%，随机卷曲结构约占56.05%。蛋白功能域（保守区）分析结果表明，FOXO蛋白92181位氨基酸属于FOXO家族特有的翼状螺旋叉头结构域。各物种中FOXO序列前中段叉状头结构部分高度保守；聚类分析结果表明家蚕FOXO蛋白归属于昆虫的FOXO，且与鳞翅目昆虫的亲缘关系最近，与脊椎动物的进化关系较远，符合传统意义上的进化关系。因此，将所克隆的基因命名为家蚕Foxo基因（GenBank登录号：JQ081294）。2家蚕Foxo基因的时空表达谱组织表达谱表明，Foxo基因在5龄第3日幼虫各组织中均有表达，但表达量存在差异性，Foxo基因在卵巢、头部、脂肪体、血淋巴中的表达量都较高，在精巢、丝腺中的表达量都较低，家蚕5龄第3日幼虫多组织芯片表达谱结果一致。发育时期表达谱表明，Foxo基因在催青加温后的胚胎发育前期（E3E4d），以及2龄至预蛹期的表达量均较低，只有1龄起蚕、蛹期和蛾期有较高量表达。在化蛹第3日时，雄蛹脂肪体中的表达量显著高于雌蛹，雌雄表达差异非常大；羽化后雌蛾脂肪体中的Foxo基因均有高表达量，但仍低于雄蛾。3FOXO与蜕皮激素诱导的PCD过程的关系为了研究蜕皮激素对家蚕Foxo基因表达的影响，调查了Foxo、EcR、E74A、InR、PTEN、Ywhaz（14-3-3zeta）、Tor1、Atg8、Saposin-like等基因在家蚕幼虫丝腺和BmN细胞的表达量。在正常发育家蚕5龄期幼虫丝腺中，根据EcR和E74A基因的表达量推测可知，丝腺中蜕皮激素含量的变化情况与血淋巴中一致，即5龄前期蜕皮激素含量一直维持低水平，在5龄第6日开始上升，进入熟蚕期后丝腺中蜕皮激素含量增幅变大。同时Foxo基因表达量也在5龄第6日开始上升，在熟蚕期Foxo基因表达量也急速上升，以及FOXO蛋白表达量也升高。已有研究表明，20E对磷酸化水平起到抑制作用，且本研究结果发现抑制FOXO活性的InR、Ywhaz的核酸水平的表达量在预蛹期相对较低，随后的预蛹期凋亡相关基因E74A与Saposin-like的表达量迅速上调。因此推测，FOXO被20E诱导表达，并在熟蚕期最大程度地发挥其诱导细胞凋亡的生物学功能。对4龄第4日家蚕个体进行外源20E注射之后，发现随着蜕皮激素20E含量上升，FOXO基因和蛋白表达水平均上调；对BmN细胞进行外源20E处理后，同样发现20E诱导了Foxo基因上调表达。在Foxo基因表达量升高的同时，E74A、Atg8与Saposin-like的表达量均升高，且相对于对照组始终保持较高水平的表达量，同时对BmN细胞荧光染色观察发现，BmN细胞的确在20E处理后发生了自噬和凋亡的现象。根据以上结果推测，FOXO参与了蜕皮激素诱导的PCD过程。4FOXO与饥饿诱导的PCD过程的关系为了研究限食与饥饿对家蚕Foxo基因表达的影响，调查了Foxo、InR、PTEN、Ywhaz（14-3-3zeta）、Atg8、Saposin-like等基因在家蚕幼虫丝腺和BmN细胞的表达量。对家蚕幼虫进行限食与饥饿处理后，丝腺中InR基因的表达量上调，而已有研究表明饥饿使家蚕素滴度降低，推测限食与饥饿处理后丝腺对胰岛素信号的敏感性显著增强，但饥饿处理后增强的程度比限食处理更显著。丝腺中Foxo基因的表达量在限食与饥饿处理后显著上调，虽然丝腺中胰岛素信号敏感性增强，但Ywhaz基因表达量下调，推测营养因子缺乏能上调丝腺中Foxo基因的表达量，可能导致FOXO的活性加强，且营养因子缺乏程度越大，FOXO的活性就越强，活化的FOXO进而可能参与了家蚕丝腺退化消亡过程。细胞实验结果表明，饥饿能诱导BmN细胞自噬和凋亡的发生。而在此过程中，Foxo基因的表达量上调，虽然InR基因表达量上调导致胰岛素信号敏感性增强，但抑制磷酸化进程的PTEN基因的表达量提前于InR基因并大幅上调，暗示磷酸化水平被较大程度的抑制。Saposin-like的表达量在Foxo基因的表达量上调之后也大幅上调，因此推测饥饿处理后，BmN细胞中FOXO的活性增强，且FOXO与细胞凋亡的发生联系密切，FOXO参与了饥饿诱导的PCD过程。5干涉家蚕Foxo基因研究结果根据调查得到的干涉组与对照组注射处理24h、48h、72h后的丝腺组织中Foxo基因的表达谱，可以确定设计的3对siRNA片段：siRNA490、siRNA821和siRNA1161对Foxo基因均有干涉效果，而其中siRNA821的干涉效果最显著，最有效。通过分析干涉组与对照组丝腺组织中Foxo、Atg8与Saposin-like基因的表达谱，推测FOXO与自噬的联系较为紧密，且FOXO表达量的瞬时上调能诱导自噬的发生。丝腺细胞核染色及DNA电泳检测结果显示，Foxo基因干涉后，家蚕丝腺细胞的凋亡过程延后，这一结果证实了FOXO的确参与了蜕皮激素诱导的PCD过程；然而干涉Foxo基因后家蚕个体的表型和化蛹结茧都没有出现明显的异常现象，说明干涉程度并没有达到显著降低该基因发挥基础生物学功能的表达量的要求，只是延缓了丝腺细胞PCD的过程。6家蚕细胞死亡早期自噬与凋亡的关系本研究发现，在个体水平上，无论正常发育还是蜕皮激素处理后，Atg8基因的表达量上调时期均在Saposin-like之前，暗示自噬发生于细胞凋亡之前，这与已有的形态学研究结论一致；在细胞水平上，在蜕皮激素或饥饿处理后，对BmN细胞染色观察发现自噬现象均优先于凋亡发生，同时在饥饿处理后，Atg8基因的表达量上调优先于Saposin-like。干涉Foxo基因之后发现，Atg8基因高表达量时期延后，而Saposin-like表达量上调时期也延后。根据相关研究结果推测，家蚕细胞自噬也可能发挥了抑制细胞凋亡或坏死，保护细胞的作用，这为家蚕细胞自噬与凋亡之间可能存在的联系提供了新的依据。