稻飞虱与黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶和RDL的差异及毒理学特性研究

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褐飞虱Nilaparvata luges Stal (Brown planthopper, BPH)是目前最主要的水稻害虫之一。化学防治是其目前最为常见的防治手段。但长期的化学防治不仅危害了生态环境,更导致了褐飞虱对多种化学杀虫剂产生了极强的抗性。因此,摒弃单一的化学防治,采用化学防治与生物防治相结合的综合治理措施显得尤为必要。黑肩绿盲蝽Cyrtorrhlnus lividlpennis Bedt作为褐飞虱最重要的天敌之一,其对褐飞虱低龄若虫及卵的数量控制效果明显。但是由于生存环境与稻田飞虱相似,黑肩绿盲蝽种群在褐飞虱的化学防治的同时也遭到了破坏。因此,开发一种既对褐飞虱有显著效果,又对其天敌黑肩绿盲蝽危害较小的化学杀虫剂是一种全新的思路。本文首先对这两种昆虫进行了6种杀虫剂的敏感性差异评价,再从分子水平上,先后通过现代分子生物学实验和测序技术,对黑肩绿盲蝽的靶标分子进行相关研究。主要研究结果如下:一、黑肩绿盲蝽与褐飞虱对6种杀虫剂的毒力测定与敏感性差异利用药膜法对2013年采自我国广西南宁地区同一片稻田的黑肩绿盲蝽与褐飞虱的三龄若虫进行了杀虫剂敏感性测定。结果显示,测试的6种杀虫剂中,除了醚菊酯之外,黑肩绿盲蝽相较于对其余5种杀虫剂(氟虫腈,仲丁威,甲萘威,对氧磷,二嗪氧磷)均表现出显著的敏感性。其中黑肩绿盲蝽对仲丁威,甲萘威,对氧磷,二嗪氧磷的敏感性分别为褐飞虱的5.05倍,5.44倍,3.67倍,2.84倍。黑肩绿盲蝽对于氟虫腈的敏感性达到了褐飞虱的12.81倍,表现出很强的敏感性。二、稻飞虱与黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因差异分析通过高通量测序技术,获得的转录组数据库,通过检索转录组数据库中的基因序列和手工拼接,获得两条可能编码乙酰胆碱酯酶的基因序列。在这两个已有基因片段的基础上设计出特异引物,采用巢式PCR和RACE技术,克隆了基因全长,并进行相关分析。根据相似性将两个乙酰胆碱酯酶基因分别命名为黑肩绿盲蝽的AChE1基因Cl-acel和AChE2基因Cl-ace2。同源性分析发现,这两个基因与包括稻飞虱在内的昆虫乙酰胆碱酯酶两个基因有很高相似性。三、黑肩绿盲蝽RDL亚基的克隆与比对分析在转录组数据库的基础上,通过人工查找和基因比对,查找到数据库中多条与昆虫RDL基因相似的序列。经过转录组数据库的搜索比对中发现了黑肩绿盲蝽RDL基因的两种不同转录本,主要差异为M3和M4两个跨膜区之间的胞内区之间有一段长度为31aa的氨基酸序列的插入。在此基础上利用RACE技术进行基因克隆,获得了黑肩绿盲蝽这两种RDL基因全长。经过分析后分别将其命名为C1-RDL和C1-RDL-In。四、稻飞虱与黑肩绿盲蝽RDL对氟虫腈敏感性的差异通过体外表达和双电极电压钳记录技术,记录了黑肩绿盲蝽两种RDL亚基与褐飞虱RDL亚基对GABA和氟虫腈的敏感性差异。结果表明,黑肩绿盲蝽C1-RDL, C1-RDL-In比褐飞虱N1-RDL对GABA和氟虫腈更加敏感,C1-RDL-In相较于C1-RDL对氟虫腈有一定程度上的敏感性下降,但黑肩绿盲蝽两个RDL之间对GABA的敏感性没有显著差异。在随后洗脱了氟虫腈之后的电流监测中发现,黑肩绿盲蝽C1-RDL-In的电流反应出现了明显的恢复,而对C1-RDL的检测中没有发现这种现象。这可能预示着,黑肩绿盲蝽RDL亚基中的插入片段对RDL亚基的生理功能上有特殊的作用,可能与氟虫腈的耐受性相关。
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