【摘 要】
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莲(Nelumbo nucifera),又名荷花,为莲科莲属的多年生水生草本花卉,是中国十大传统名花之一。‘大洒锦’,是一种大株型重瓣观赏莲,白色花瓣边缘着紫红色条纹,有洒金之美,属荷中绝品,有极高的观赏价值和市场应用前景。‘大洒锦’的红斑形成与花色苷积累密切相关,花色苷合成途径的结构基因受MYB基因的转录调控。为了探究莲‘大洒锦’花斑形成的分子机理,本研究在前期研究基础上,筛选出着色相关MYB基
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莲(Nelumbo nucifera),又名荷花,为莲科莲属的多年生水生草本花卉,是中国十大传统名花之一。‘大洒锦’,是一种大株型重瓣观赏莲,白色花瓣边缘着紫红色条纹,有洒金之美,属荷中绝品,有极高的观赏价值和市场应用前景。‘大洒锦’的红斑形成与花色苷积累密切相关,花色苷合成途径的结构基因受MYB基因的转录调控。为了探究莲‘大洒锦’花斑形成的分子机理,本研究在前期研究基础上,筛选出着色相关MYB基因,并对其进行了 CDS克隆、序列分析和功能验证等研究,主要结果如下:1.徒手切片观察花瓣红白部分的色素差异积累,结合实验室前期数据,确定花色差异来源为花色苷在花瓣红白部分的积累不同。2.综合分析转录组数据库,筛选出14个花色苷代谢通路调控基因,包含6个MYB转录因子和8个bHLH转录因子;利用实时荧光定量分析和进化树构建确定了 4 个 MYB 候选基因,分别为NnMYB2(LOC104609338)、NnMYB3(LOC104609339)、NnMYB114a(LOC1 04599741)和 NnMYB114b(LOC104598467)基因,为S6亚组R2R3型MYB转录因子,可能与花色苷合成相关。克隆了NnMYB2、NnMYB3、NnMYB114a和NnMYB114b基因CDS全长,同时对序列进行生物信息学分析。发现4个基因均有2个SANT保守结构域,符合R2R3-MYB家族的典型特征;编码蛋白均为亲水性蛋白,二级结构仅有α-螺旋、延伸链和无规则卷曲。三级结构具有一定的相似性,预测的亚细胞定位均在细胞核中。3.实时荧光定量分析基因的表达模式,发现NnMYB2、NnMYB3、NnMYB114a和NMnYB114b基因在不同组织和器官中均有表达。构建超表载体,以农杆菌介导法完成早花烟草和拟南芥的异源转化。结果表明NnMYB2基因超表早花烟草出现白花表型,对花色苷合成有抑制作用,NnMYB114a基因超表早花烟草花瓣颜色明显加深,并且转基因植株的叶片、萼片、雄蕊和果皮均有不同程度的着红色,对花色苷积累有明显的促进作用;超表拟南芥的T2代幼苗表型特征不如转基因烟草中明确。4.克隆2个具有功能的NnMYB2基因和NnMYB114a基因起始密码子上游1.5-2.0kb序列,并进行元件分析。与基因组数据比对发现,莲‘大洒锦’NnMYB2和NnMYB114a基因的启动子序列未发生变异。NnMYB2和NnMYB114a基因启动子元件可分为4种类型,即光响应相关、植物激素响应相关、胁迫响应相关和其它表达相关,其中光响应元件数目最多,暗示NnMYB2和NnMYB114a基因的功能发挥可能与光有关。5.预测NnMYB2和NnMYB114a基因与其它基因的互作关系及下游结构基因。筛选出可能互作的转录因子NnbHLHl(LOC104612399),构建NnMYB2基因、NnMYB114a和NnbHLH1基因的酵母双杂交BD载体进行自激活验证,发现NnMYB2基因具有强烈的自激活功能,NnMYB114a基因具有轻微的自激活功能,而NnbHLH1基因没有自激活功能;综合转录组和蛋白组的表达量结果,筛选出可能导致花色苷含量差异的结构基因NnUFGT(LOC104613453)。
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