哺乳类动物肝脏在物理的(如部分肝切除、缺血/再灌注)或化学的(如CCL4)刺激后,便显示出强大的再生能力。肝脏是一种由十多种细胞构成的复杂器官,肝脏结构及其功能的恢复要依赖各种肝脏细胞体积和数量的增加,以及不同肝脏细胞或同种细胞间的相互作用。作为组成肝脏的主要非实质细胞,肝窦内皮细胞(Liver sinusoidial endithlial cells, LSEC)在肝再生启动中起重要作用。但目前在分子水平上有关肝窦内皮细胞在肝再生中作用的研究很少。因此,本论文试图通过检测窦内皮细胞的基因动态表达谱以揭示它与肝脏再生的关系。首先,我们按Higgins等描述的方法建立大鼠70%部分肝切除(Partial hepatectomy, PH)动物模型,用两步灌流和胶原酶消化法分散肝脏细胞,用Percoll密度离心与抗CD31-免疫磁珠分选相结合的方法分离纯化PH后10个不同恢复时点的再生肝窦内皮细胞。利用窦内皮细胞标志蛋白CD14和ET-1进行免疫细胞化学检测窦内皮细胞的纯度,分析显示分离的窦内皮细胞纯度在95%以上。最后用含11789个已知基因和13231个未知基因,占大鼠基因组基因85%的Rat Genome 230 2.0芯片检测了PH后10个恢复时间点大鼠再生肝窦内皮细胞的基因转录谱。为验证芯片结果的可靠性,本研究用荧光定量RT-PCR检测了再生肝窦内皮细胞中GAPDH、UBC、JUN、TTR、MYC、PCNA、APOE、TRIM24、CD14和ET-1等10个基因的表达变化情况,对肝窦内皮细胞的芯片检测结果进行分析,发现共1629个基因与肝再生相关,包括833个已知基因及796个功能未知的未知基因。K-means方法分析显示,833个已知基因大致呈现8种表达模式:即(1)肝再生启动期快速上调,PH后6 h达到表达高峰,然后快速降低,72 h时再次达到高峰;(2)肝再生增殖期显著上调,然后逐渐减弱;(3)肝再生启动期快速上调,并迂回减弱,终止期再次上调;(4)PH后逐渐上调;(5)PH后快速下调并快速恢复;(6)PH后快速下调并逐渐恢复;(7)PH后整体下调,30 h达到最低;(8)肝再生早期稍微上调后逐渐下调,终止期达到最低。基因功能分析显示,这些基因参与细胞信号转导、凝血反应、血管形成、血管收缩、细胞代谢、细胞发生、生长、增殖、分化、免疫炎症、解毒、活性物质分泌等多种生物活动。用Fisher精确检验分析这些基因功能群在8种表达模式中的富集情况,并结合通过普函数计算的基因协同效应发现,PH后短时间内,参与窦内皮细胞重要生理功能(凝血、细胞吞噬和物质运输)的基因被激活,表明肝再生早期窦内皮细胞功能有恢复的趋势;解毒相关基因在再生早期表达增强,利于肝再生中废物的清除;活性物质分泌调控活动在PH后6 h开始增强,与下游细胞因子基因表达在时间上相偶联;免疫炎症、防御应答及免疫炎症信号途径相关基因虽在再生早期减弱,但协同效应结果显示它们肝再生几乎无显著变化,很显然基因的协同效应并非是单个基因作用的简单叠加;氨基酸代谢在肝再生早期增强,在终止期减弱;糖合成相关基因在再生早期表达上调,而糖代谢基因在再生后期表达减弱,根据协同效应结果发现,肝再生早期窦内皮细胞的糖合成活动增强,终止阶段无论糖合成还是糖酵解活动均减弱。另外,细胞增殖相关基因的表达在部分肝切除术30 h后恢复,这有利于肝再生中肝窦内皮细胞增殖。总之,肝再生中基因功能群富集和基因协同作用相结合的分析方法将助于揭示窦内皮细胞与大鼠肝再生的相关性。为探讨796个未知基因在肝再生中作用,本研究首先通过电子克隆预测它们编码的氨基酸序列,发现其中486个未知基因具有相应的氨基酸序列。根据本实验室建立的大鼠蛋白质亚细胞定位方法进行预测,发现大部分基因编码产物定位在细胞外基质、细胞质膜和细胞核中,表明它们可能参与组织结构重建、细胞膜形成和基因转录调控等活动。总之,上述预测结果为下一步实验研究其功能提供了有价值的参考。