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根据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF）最新报告,2017年全球约4.25亿成人患糖尿病,预测数据显示到2045年,全球将有6.29亿糖尿病患者。2017年全球20-79岁年龄段成人糖尿病患病率大约为8.8%,预计到2045年该数值将达到9.9%,而中国的糖尿病患病率为10.9%。目前中国存在1.343亿的糖尿病患者。2017年,全球20-79岁年龄段成人约有400万人死于糖尿病。而在中国死于糖尿病的患者约有84万人。糖尿病增加心血管疾病的发病率和死亡率,是一种独立危险因素。糖尿病可引起心脏充盈受损,收缩功能下降,心肌肥厚和纤维化等,我们称之为糖尿病心肌病。因此,如何预防和延缓糖尿病患者心肌损伤是糖尿病管理中的核心问题。褪黑素主要由松果体合成和分泌的。前期研究证明褪黑素调节各种生理,神经内分泌功能和心血管系统。褪黑素可以直接清除自由基具有抗氧化功能。它还可以调节血压同时抑制动脉粥样硬化的进程。作为Hippo通路中的关键组分,哺乳动物STE20样激酶1（Mst1）调节细胞凋亡和细胞增殖。Mst1存在于心脏组织中并通过调节自噬来确定心肌细胞的命运。最近的研究表明Mst1信号传导调控许多心血管疾病,包括主动脉夹层,主动脉瘤,动脉粥样硬化和心肌梗塞缺血性损伤。然而,Mst1信号通路是否能够调节糖尿病心肌病的发生发展目前仍不清楚。因此,本研究分别从整体动物和细胞水平探讨褪黑素在糖尿病心肌病损伤中的作用以及Mst1介导的信号通路在其损伤中的作用,为糖尿病心肌病的诊治提供新的作用靶点。【目的】1.构建糖尿病小鼠模型,观察褪黑素对糖尿病小鼠心脏功能的作用。2.分离培养乳鼠原代心肌细胞,观察褪黑素对高糖培养条件下心肌细胞自噬水平的影响。3.明确Mst1在糖尿病心肌病损伤中的作用,证实Mst1/Beclin1信号通路介导的自噬在糖尿病心肌病中的作用。4.明确褪黑素是否通过调节Mst1发挥其糖尿病心肌病保护作用的。【研究方法】1.C57小鼠随机分为四组:野生型小鼠组（Con）,褪黑素干预小鼠组（Con+Mel）,糖尿病小鼠组（DM）,糖尿病褪黑素干预小鼠组（DM+Mel）。2.野生型小鼠和Mst1-/-小鼠随机分为四组:野生型小鼠组（WT）,Mst1基因敲除小鼠组(Mst1-/-),糖尿病小鼠组（DM）,糖尿病Mst1基因敲除小鼠组(DM+Mst1-/-)。3.野生型小鼠和Mst1基因过表达小鼠随机分为4组:野生型小鼠组（NTg）,Mst1基因过表达小鼠组（Tg-Mst1）,糖尿病模型组（DM）,Mst1基因过表达小鼠糖尿病模型组（DM+Tg-Mst1）。4.野生型小鼠和Mst1-/-小鼠随机分为六组:野生型小鼠组（Con）,糖尿病小鼠组（DM）,Mst1基因敲除小鼠组(Mst1-/-),褪黑素干预Mst1基因敲除小鼠组(Mst1-/-+Mel),糖尿病Mst1基因敲除小鼠组(Mst1-/-+DM),褪黑素干预糖尿病Mst1基因敲除小鼠组(Mst1-/-+DM+Mel)。5.野生型小鼠和Mst1基因过表达小鼠随机分为6组:野生型小鼠组（Con）,糖尿病模型组（DM）,Mst1基因过表达小鼠组（Tg-Mst1）,Mst1基因过表达小鼠褪黑素干预组（Tg-Mst1+Mel）,Mst1基因过表达小鼠糖尿病模型组（Tg-Mst1+DM）,Mst1基因过表达小鼠糖尿病模型褪黑素干预组（Tg-Mst1+DM+Mel）。6.腹腔注射链脲佐菌素（STZ）按照50 mg/kg/d的标准构建糖尿病小鼠模型。褪黑素（20 mg/kg/day）干预糖尿病小鼠4周,继续饲养至3个月末,超声检测各组小鼠心脏功能。7.培养乳鼠原代心肌细胞,100μM褪黑素干预4个小时,33 mmol/L葡萄糖的高糖模拟糖尿病模型,随机分为以下4组:对照组（Con）;褪黑素干预组（Con+Mel）;高糖组（HG）;褪黑素干预高糖组（HG+Mel）。8.培养乳鼠原代心肌细胞,转染携带有Mst1 shRNA的腺病毒,33 mmol/L葡萄糖的高糖模拟糖尿病模型,随机分为以下6组:对照组（Con）;腺病毒对照组（Con+Ad-LacZ）;Mst1下调组（Con+Ad-sh-Mst1）;高糖组（HG）;腺病毒高糖对照组（HG+Ad-LacZ）;高糖Mst1下调组（HG+Ad-sh-Mst1）。9.培养乳鼠原代心肌细胞,转染携带有Mst1的腺病毒,33 mmol/L葡萄糖的高糖模拟糖尿病模型,随机分为以下6组:对照组（Con）;腺病毒对照组（Con+Ad-Control）;Mst1上调组（Con+Ad-Mst1）;高糖组（HG）;腺病毒高糖对照组（HG+Ad-Control）;高糖Mst1上调组（HG+Ad-Mst1）。10.培养乳鼠原代心肌细胞,转染携带有Mst1 shRNA的腺病毒,100μM褪黑素干预4个小时,33 mmol/L葡萄糖的高糖模拟糖尿病模型,随机分为以下4组:Mst1下调组（Ad-sh-Mst1）;褪黑素干预Mst1下调组（Ad-sh-Mst1+Mel）;高糖Mst1下调组（HG+Ad-sh-Mst1）;褪黑素干预高糖Mst1下调组（HG+Ad-sh-Mst1+Mel）。11.培养乳鼠原代心肌细胞,转染携带有Mst1的腺病毒,100μM褪黑素干预4个小时,33 mmol/L葡萄糖的高糖模拟糖尿病模型,随机分为以下4组:Mst1上调组（Ad-Mst1）;褪黑素干预Mst1上调组（Ad-Mst1+Mel）;高糖Mst1上调组（HG+Ad-Mst1）;褪黑素干预高糖Mst1上调组（HG+Ad-Mst1+Mel）。12.Western blotting法检测各组自噬相关蛋白的表达水平。13.培养原代心肌细胞,转染GFP-LC3腺病毒检测原代心肌细胞中GFP-LC3的水平。14.透射电镜观察心肌组织和原代心肌细胞中线粒体和自噬小体的形态及数量。15.JC-1染色法检测各组原代心肌细胞中线粒体膜电位水平。【研究结果】1.褪黑素减轻糖尿病引起的心功能障碍,上调心肌组织的自噬水平。2.Mst1基因敲除(Mst1-/-)能够促进心肌的糖摄取,改善糖尿病引起的心功能障碍,上调心肌组织的自噬水平。3.Mst1基因过表达能够降低心肌的糖摄取水平,加重糖尿病引起的心功能障碍,降低心肌组织的自噬水平。4.透射电镜结果提示Mst1基因敲除可以促进糖尿病小鼠心肌组织自噬小体的生成。高糖培养原代心肌细胞,下调Mst1可以上调自噬水平和线粒体膜电位水平,抑制心肌细胞凋亡。5.褪黑素无法改善Mst1基因敲除糖尿病小鼠的心功能障碍,无法上调其心肌组织的自噬水平,无法增加高糖Mst1下调处理后原代心肌细胞的自噬水平。结果提示Mst1敲除阻碍褪黑素对糖尿病心肌病发挥保护作用。6.褪黑素改善Mst1基因过表达糖尿病小鼠的心功能障碍,上调其心肌组织的自噬水平,增加高糖Mst1上调处理后原代心肌细胞的自噬水平。说明褪黑素通过抑制Mst1发挥其心肌保护作用的。7.Western blotting结果显示糖尿病小鼠心肌组织中p-Mst1,Mst1和p-Mst1/Mst1比率均增加,自噬标志蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表达量下降。而在Mst1基因敲除的糖尿病小鼠心肌组织中自噬标志蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表达量显著上升。褪黑素抑制糖尿病小鼠心肌组织中p-Mst1,Mst1的表达,上调自噬标志蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表达量。【结论】通过该项目的研究,我们发现褪黑素减轻糖尿病引起的小鼠心功能障碍,增加心肌组织的自噬水平;Mst1基因敲除可以减轻糖尿病引起的小鼠心功能障碍,增加心肌组织的自噬水平,而褪黑素无法进一步改善Mst1基因敲除的糖尿病小鼠心功能障碍。说明褪黑素通过调节Mst1介导的信号通路发挥其心肌保护作用,为糖尿病心肌病的诊治提供新的靶点。