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胸腺素(Thymo sin)是一种广泛存在于真核生物体内,并广泛参与了多种生物学途径的蛋白分子。目前,关于胸腺素的研究主要集中在脊椎动物中,而对无脊椎动物胸腺素的研究还不是很广泛,尤其是针对家蚕胸腺素基因的相关报道还比较少。 本研究通过生物信息学分析,以及分子克隆的方法得到家蚕中存在的两种胸腺素基因,并对它们的结构和功能进行了初步探究,进行了基因组分析、表达时相、蛋白的相互作用以及是否促进细胞的增殖与迁移等方面的研究。得到的结果如下: 1、通过生物信息学的比对发现家蚕中存在两种胸腺素基因,分别命名为BmTHY1和BmTHY2(GenBank登录号分别为:NM_001047021.1,FJ602790.1)。BmTHY1和BmTHY2基因相似度极高,两者分别编码170、132个氨基酸,蛋白相对分子量分别为21kDa、16kDa,且两个基因都位于家蚕第23号染色体上。多序列比对表明:家蚕胸腺素蛋白BmTHY1、 BmTHY2与棉铃虫(Helicoverpaarmigera)胸腺素蛋白HaTHY1、HaTHY2(GenBank:ADD21556.1,ADD21557.10)相似度高达94%。 2、为明确BmTHY1、BmTHY2是否源自于同一基因,构建跨内含子特异性引物。该引物以cDNA为模板可同时克隆到BmTHY1、Bm THY2基因全长序列。利用这对引物在基因组水平上进行扩增,结果证实两者为同一基因的不同剪切副本,二者为同源异构体,主要差别是BmTHY2基因较BmTHY1缺失了第三个外显子。 3、为了了解BmTHY1、BmTHY2基因的生物学功能,分别构建了BmTHY1、BmTHY2蛋白的原核表达载体,载体携带有GST融合标签,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达。用谷胱甘肽层析柱进行蛋白纯化后,再用凝血因子Factor Xa进行柱上消化,得到纯化的BmTHY1、BmTHY2蛋白。以BmTHY2为抗原免疫昆明小鼠获得多克隆抗血清。 4、利用多克隆抗血清,在翻译水平检测了两种蛋白的表达时相及组织分布情况。Western Blot结果表明:在家蚕整个生活周期,两种蛋白都有表达且表达量逐步升高。在蛹期,BmTHY2的表达量非常高,推测它可能参与了家蚕的变态发育。除血淋巴外,两者在中肠、精巢、卵巢、头部中均有分布。此外,在脂肪体中仅有BmTHY1存在。这表明两者在功能上存在在一定差异。 5、在验证家蚕胸腺素蛋白BmTHY1、BmTHY2是否参与到家蚕细胞BmN抵抗病毒BmNPV过程中,发现了在细胞感染后的不同时间段,细胞内BmTHY1、BmTHY2在表达量上的差异。研究表明,随着感染时间的延长,细胞内BmTHY1、BmTHY2表达量逐渐下降。推测可能是由于病毒与宿主博弈过程中,病毒衣壳蛋白与BmTHY1、BmTHY2竞争结合G-actin所致。 6、体外蛋白相互作用实验表明:BmTHY1、BmTHY2均能与家蚕中肠的actin、14-3-3以及BmNPV病毒的泛素蛋白发生互作。 7、探究家蚕胸腺素BmTHY1、BmTHY2是否与人类胸腺素Tβ4功能相似,分别将二者作用于胃癌细胞。结果证明,BmTHY1对于细胞增殖、迁移均有明显促进作用,而BmTHY2却只能促进细胞的迁移。