论文部分内容阅读
第一部分血浆循环miRNA分析用于结直肠癌诊断的研究研究目的结直肠癌(CRC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,目前其仍缺乏有效的无创性筛查手段,而微小RNA(miRNA)已经明确与肿瘤的发生发展密切相关,并且可以直接或间接的反映肿瘤阶段性变化,具有作为诊断标志物的潜在价值。本研究旨在充分挖掘血浆miRNA在CRC诊断中的价值,寻找新的诊断标志物。研究方法采集10例CRC和10例正常对照者血浆,分为两组充分混合后,提取总RNA,采用microRNA PCR芯片进行miRNA表达谱分析,筛选在CRC患者血浆中差异表达的miRNA分子。随后运用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术在独立样本组中进行验证。采用受试者工作曲线(ROC curve)分析血浆miRNA对CRC及结直肠进展期腺瘤的诊断价值。研究结果血浆miRNA表达谱分析结果显示,在CRC血浆中上调的靶点有9个,下调的靶点13个。去除5个文献已经有报道的靶点,运用qRT-PCR技术对剩余17个候选靶点进行了验证,发现与正常对照组相比,CRC组及进展期腺瘤组血浆miR-601和miR-760水平均显著下调(P<0.001)。ROC曲线分析显示,血浆miR-601和miR-760诊断CRC的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.747和0.788,诊断进展期腺瘤的AUC分别为0.638和0.682。联合这两个靶点诊断CRC的AUC为0.792,敏感性和特异性分别为83.3%和69.1%；诊断进展期腺瘤的AUC为0.683,敏感性和特异性分别为72.1%和62.1%。另外,与仅运用癌胚抗原(CEA)相比,补充检测miR-601和miR-760后,可以将Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌的检出率从27.5%提高至86.3%。结论血浆miR-601和miR-760是潜在的CRC诊断分子标志物；血浆miRNA分析是一种新的非侵入性CRC早期诊断方法。第二部分miR-202-3p抑制结直肠癌生长的研究研究目的研究miR-202-3p在CRC发展过程中的生物学功能,并通过临床样本验证评价其在CRC诊断、分型、预后判断中的应用价值。研究方法采用Agilent miRNA表达谱芯片分析10对CRC组织(与癌旁正常组织比较)的miRNA表达谱,并结合文献追踪,初筛CRC生长相关miRNA分子。挑选预实验中具有抑制细胞增殖作用并且在CRC组织中下调的miR-202-3p进行分子机制研究,利用慢病毒载体构建了miR-202-3p的稳定细胞株,运用细胞培养、生长曲线分析、克隆形成实验、细胞转染等技术分析miR-202-3p对CRC肿瘤生长的影响。同时使用qRT-PCR技术检测临床CRC标本中miR-202-3p的表达,分析miR-202-3p与CRC患者预后及肿瘤临床病理表型的关系。研究结果miRNA表达谱分析结果显示,CRC组织的miRNA表达谱式与对应正常粘膜组织相比存在显著差异,共筛选到81个靶点差异表达靶点(筛选条件：P<0.05,差异>2倍且flags≥10)。芯片结果显示miR-202-3p在CRC组织中下调,临床大样本验证证实了这一结果,但其表达量与肿瘤分期、分化、大小及总生存均无显著相关性。利用分子生物学技术瞬时或稳定过表达miR-202-3p,可以显著抑制CRC细胞(HCT-116和LoVo)的生长,而利用抑制剂使miR-202-3p表达降低后,可以促进CRC细胞(HCT-116和LoVo)的增殖。结论与正常结直肠组织相比,CRC组织的miRNA表达谱存在显著差异；miR-202-3p具有抑制CRC细胞增殖的作用,是潜在的CRC抑癌基因。第三部分miR-202-3p靶基因的筛选及鉴定研究目的通过软件预测及分子生物学方法筛选并鉴定miR-202-3p的靶基因,并探讨miR-202-3p如何通过其靶基因参与调控CRC的发生发展。研究方法采用基因芯片技术分析瞬时过表达miR-202-3p的结直肠癌HCT116与LoVo细胞株的表达谱与对照细胞的差异,同时运用miRNA靶基因预测软件TargetScan和miRanda对miR-202-3p的靶基因进行生物信息学预测。根据芯片分析验证及生物信息学预测筛选出miR-202-3p的候选靶基因,克隆其3’-UTR上miR-202-3p可能的结合位点,运用荧光素酶试验初步分析miR-202-3p对这些基因的表达是否具有调控作用,缩小miR-202-3p靶基因范围。进一步运用si-RNA技术分析候选靶基因与miR-202-3p的功能联系。最后运用qRT-PCR术验证候选靶基因在CRC组织中的表达情况。研究结果根据生物信息学预测及基因芯片验证结果,筛选出12个候选靶基因纳入后续鉴定,其中8个基因的3’-UTR结合位点克隆构建成功。荧光素酶实验显示,ATXN7L2、ARL5A、LRIG3、STARD13、HECTD2、CPEB4基因的3’-UTR重组报告质粒的荧光素酶活性显著下调。si-RNA功能分析表明抑制ATXN7L2、ARL5A、LRIG3、STARD13基因表达具有抑制CRC细胞生长功能,同时与miR-202-3p抑制剂共转染实验表明,抑制上述候选靶基因表达后,下调miR-202-3p的表达不再出现促进细胞增殖的现象,具有显著的功能回复作用。进一步检测了CRC组织中上述四个潜在靶基因的表达情况,证实ARL5A基因在CRC组织中表达上调。结论ATXN7L、ARL5A、LRIG3及STARD13基因是miR-202-3p的潜在功能性靶基因,miR-202-3p可能通过抑制其表达参与CRC的发生发展。