目的:本研究旨在探讨年龄因素对缺血后适应心肌保护作用的影响,研究老龄缺血后适应心肌保护作用消失的分子机制;通过研究巨细胞病毒(CMV)启动子与鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子重组AAV9载体的组织表达特异性,筛选获得较好的可用于心脏疾病基因治疗的AAV9载体;并使用携带Ca MEK(Constitutively active MEK1,Ca MEK)基因的重组AAV9载体,靶向转导老龄小鼠心脏,探讨外源导入Ca MEK能否作为基因治疗药物,具有靶向激活ERK1/2通路,减少心肌梗死、抑制心肌细胞凋亡、防治老龄心肌缺血再灌注损伤的作用及机制。本研究包括:①应用小鼠Langendorff离体心脏灌流系统,对比研究缺血后适应对年轻与老龄小鼠心肌保护作用的差异,阐明缺血后适应心肌保护作用年龄异质性的分子机制。②通过体内外转导实验,对比研究杆状病毒载体系统包装制备的CMV与CBA启动子的重组AAV9载体介导GFP基因在小鼠体内的组织表达特异性、表达时间点、安全性,筛选更适宜用于心脏疾病基因治疗的重组AAV9载体。③靶向转导Ca MEK基因至老龄小鼠心肌,通过离体及在体心肌缺血再灌注模型,探讨Ca MEK基因过表达减轻老龄心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法:第一部分:选取3~4月龄和15~18月龄的雄性C57BL/6J小鼠,建立Langendorff离体心脏缺血后适应模型,离体再灌注(IR)心脏经受45 min全心缺血和60 min再灌注,缺血后适应(IPost)于再灌注即刻给予3个循环10s缺血+10s再灌注的IPost处理,同时年轻小鼠给予PD98059(ERK1/2抑制剂)。观测指标为心肌梗死面积、心肌细胞凋亡、p-ERK1/2、p-P70S6K及p-AKT的表达。第二部分:将剂量为1×1011vg的AAV9-CMV-e GFP及AAV9-CBA-e GFP载体分别经尾静脉注射导入C57BL/6小鼠体内,于病毒载体转导0周、1周、2周、3周、4周、5周和8周,利用激光共聚焦和Western Blot检测心、肝、脾、肺、肾、脑及骨骼肌中GFP蛋白表达;通过q-PCR检测AAV9载体在不同组织中的拷贝数,研究AAV9病毒颗粒的体内分布与存在时间,系统评价CMV与CBA启动子重组AAV9载体的组织靶向性;通过检测心肌酶、肝功及肾功能指标,评价AAV9载体转导的安全性。在细胞水平上,利用原代培养的乳鼠心肌细胞及BRL-3A大鼠肝细胞株,分别以不同感染复数(MOI=105、106、107)的AAV9-CMV-e GFP及AAV9-CBA-e GFP载体进行转染,利用荧光显微镜和流式细胞仪测定AAV9载体的体外转染效率,同时采用TUNEL染色检测心肌细胞和肝细胞的凋亡率。第三部分:选取15~18月老龄雄性C57BL/6J小鼠,分别经尾静脉注射生理盐水,AAV9-CMV-e GFP和AAV9-CMV-Ca MEK,5周后采用Western Blot法检测心肌中MEK、p-ERK1/2、p-P90RSK的表达;并于病毒转染5周后,采用Langendorff离体心脏灌流模型及小鼠在体缺血再灌注损伤模型,离体心脏处理同第一部分;在体心脏经受60 min局部缺血和24 h再灌注,观察指标为心肌梗死面积、细胞凋亡,心肌酶CK、CK-MB、LDH,Bcl-2、Bax的表达。结果:第一部分:①与直接缺血再灌注相比,缺血后适应可使年轻小鼠心肌的梗死面积显著降低(39.7±4.6%vs 24.9±2.9%,P<0.01);且心肌细胞凋亡亦显著下降(12.2±1.8%vs 7.7±1.3%,P<0.01)。②缺血后适应对老龄小鼠心肌没有保护作用,IR组和IPost组的心肌梗死面积为(49.5±7.5%vs 47.5±7.3%,P>0.05),心肌细胞凋亡率为(13.5±2.3%vs 13.7±2.4%,P>0.05),且老龄组小鼠心肌梗死面积显著高于年轻组(P<0.01)。③缺血后适应通过再灌注早期诱导年轻小鼠心肌p-ERK1/2、p-P70S6K表达的增加,但是对老龄小鼠心肌却没有这项效应,使用ERK1/2特异性抑制剂PD98059使缺血后适应对年轻小鼠心肌的保护作用完全消失,同时缺血后适应均未诱导年轻和老龄小鼠心肌p-AKT表达的增加。第二部分:①激光共聚焦和Western Blot检测发现CMV与CBA重组AAV9载体转导5周时,GFP蛋白主要在小鼠心肌和肝脏中表达,而脾、肺、肾、脑及骨骼肌中几乎未见表达。②各检测时间点CMV启动子所介导的GFP蛋白在心肌中的表达显著高于肝脏。AAV9载体转导1周后心肌和肝脏中开始表达GFP蛋白,随着时间的延长表达逐渐增强,转导第5周到达高峰,其在心脏和肝脏转染效率84.0±3.2%vs 23.6±3.4%,(P<0.01),第8周时为75.0±3.5%vs 2.2±0.3%,(P<0.01),表明AAV9-CMV-e GFP载体对心肌有极强的靶向亲和力,可在心肌中长期稳定的高效表达,但CMV启动子活性在肝脏中很容易被沉默。③AAV9-CBA-e GFP载体有极强的嗜肝性,各观察点其在肝脏中的表达显著高于心肌,亦随着时间的延长而增强,5周时表达至高峰,此时肝脏和心脏的转染效率88.0±3.9%vs 7.7±0.7%,(P<0.01),第8周时为84.4±2.4%vs 6.4±0.4%,(P<0.01)。④在各检测点,q-PCR检测发现CMV启动子的AAV9载体在心肌中的分布显著高于CBA启动子(P<0.01),而在肝脏中则显著低于CBA启动子(P<0.01),进一步证实AAV9-CMV-e GFP载体的嗜心肌性、AAV9-CBA-e GFP载体的嗜肝性。⑤生化检测发现AAV9载体转导对心肌酶LDH、CK,肝功能AST、ALT,肾功能Cr及BUN无不良影响(P>0.05)。⑥流式细胞仪检测表明CMV和CBA启动子的AAV9载体均可高效的转染心肌细胞和肝细胞,且随着感染剂量的增加而逐渐增强,但是相同感染剂量下相比,两启动子对心肌细胞的转染效率无明显差异,对肝细胞亦无显著差异(P>0.05)。⑦与未转染细胞相比,高剂量CMV与CBA启动子的AAV9载体转染并未导致的心肌细胞和肝细胞凋亡。第三部分:①Ca MEK基因转导可高效激活老龄小鼠心肌ERK1/2信号通路,与对照和空病毒组相比,MEK、p-ERK1/2、p-P70S6K和p-P90RSK的表达显著增加(P<0.01)。②对于离体心脏研究,Ca MEK基因过表达有效保护老龄缺血心肌。空病毒组、Ca MEK基因转导组IR与IPost的心肌梗死面积分别为48.0±7.7%vs 44.0±8.0%、31.3±5.3%vs 28.5±6.5%,心肌细胞凋亡率分别为14.3±2.1%vs 13.6±1.9%、5.0±1.3%vs 4.9±1.2%,心梗面积及细胞凋亡率与空病毒组相比差异均有统计学意义(P<0.01),表明ERK1/2信号通路激活后有效保护老龄缺血心肌。③对于在体心脏研究,Ca MEK基因过表达同样可有效降低老龄小鼠心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率。老龄小鼠心肌缺血1h,再灌注24h后,Control、空病毒及Ca MEK三组的心梗面积分别为44.2±7.4%vs 43.4±6.0%vs 27.5±4.7%;心肌细胞凋亡率分别为16.1±1.9%vs16.4±2.0%vs 5.5±2.3%,与Control和空病毒组相比差异均有统计学意义(P<0.01);凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax显著增加,与空病毒相比P<0.01。④Ca MEK组的心肌酶CK、CK-MB、LDH亦显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:①ERK1/2信号通路是参与并介导缺血后适应心肌保护作用年龄异质性的关键靶点。缺血后适应在再灌注早期通过激活ERK1/2信号通路减轻年轻小鼠心肌缺血再灌注损伤,AKT信号通路并未参与缺血后适应的心肌保护作用;②缺血后适应对老龄小鼠心肌没有保护作用与ERK1/2信号通路未有效激活有关,且老龄小鼠心肌对缺血再灌注损伤的敏感性显著增加,再灌注后心肌梗死面积显著增加。③CMV启动子的重组AAV9载体可在小鼠心肌中长期稳定的高效率表达,但在肝脏中CMV启动子活性很容易被沉默,AAV9-CMV载体是一种较为理想的心脏疾病基因治疗载体;④CBA启动子的重组AAV9载体对肝脏有极高的亲嗜性,可介导外源基因在肝脏中长期稳定的高效表达,是较为理想的肝脏疾病基因治疗载体系统。⑤靶向激活心肌ERK1/2信号通路激发心肌内源性抗损伤能力是防治老龄心肌缺血再灌注损伤的关键环节,Ca MEK基因可以作为小分子基因治疗药物,具有靶向激活ERK1/2信号通路,减少心肌梗死、抑制心肌细胞凋亡,防治老龄小鼠心肌缺血再灌注损伤的效果和作用,从而有效保护老龄心肌缺血损伤。