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目的:肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,在全世界恶性肿瘤中排名第三。近年来有研究表明,在肝癌发生、发展的复杂过程中,许多基因的表达及产物的活性发生了改变,其中就包括非编码小分子RNA(microRNA,miRNA)。新近研究表明,多种miRNA通过参与基因信号通路,在肝癌细胞中间接发挥癌基因和抑癌基因的功能。而作为公认的肿瘤抑制子p53(Tumorproteinp53)(由TP53基因编码),在肝癌中也被证明可以通过调控许多下游靶基因来影响肝癌细胞的生长、死亡和转移,它参与多种miRNA的调控,并作为miRNA的下游靶基因被多种miRNA调控。本课题,着重研究是否有miRNA参与到p53调控通路及其所发挥的作用,深入讨论其在肝癌中的功能和调控机制,力求为肝细胞恶性转化及肝癌的诊治提供理论依据。方法:首先,我们通过集落形成实验、Transwell迁移和侵袭实验验证p53在肝癌细胞系QGY-7703及HepG2中的作用。之后,通过生物信息学方法,预测出在LRP1基因的启动子区有p53的结合位点,并且发现miR-1228定位在LRP1基因的内含子区。之后,我们在miR-1228宿主基因LRP1上游设计两个长短不同的启动子片段,分别克隆到pGL3-basic-luc+载体,并在QGY-7703细胞中进行验证,利用luciferase双荧光素酶报告系统,结合Real-time RT-PCR技术探讨p53是否可以影响miR-1228启动子的活性。为了探讨miR-1228在肝细胞癌中的功能,我们在QGY-7703及HepG2细胞中,过表达及封闭miR-1228的表达,进行集落形成、Transwell迁移和侵袭实验。之后,我们通过生物信息学预测,发现TP53是miR-1228的靶基因,通过荧光报告载体实验,结合Real-time RT-PCR和Western blot技术验证miR-1228对其靶基因TP53的直接调控作用。随后通过Real-time PCR方法检测miR-1228和p53在20对肝癌组织和其癌旁正常组织,以及肝癌细胞系QGY-7703、HepG2和正常肝细胞系LO2中的表达情况。进而通过过表达p53对细胞的一系列挽救实验,进一步验证p53是否为miR-1228的靶基因。结果:过表达p53抑制QGY-7703及HepG2细胞的生长、迁移及侵袭。通过生物信息学预测及文献参考,我们发现LRP1基因启动子区有多个潜在的p53结合位点,且miR-1228定位在LRP1的第49和第50个外显子中间的内含子。之后,我们成功构建了 miR-1228启动子区两个长度不同的片段,并发现在QGY-7703细胞中p1546和p866均有启动子活性,且p866片段启动子活性较强,过表达p53可以抑制miR-1228启动子的活性。深入研究miR-1228在肝癌中的功能后发现,miR-1228能增强肝癌细胞QGY-7703及HepG2的生长、迁移和侵袭能力。通过生物信息学预测,我们发现TP53正好是miR-1228的候选靶基因,并证实了这种直接靶定关系及负调控关系的存在。通过对20对肝癌及癌旁组织的检测,发现miR-1228高表达的9对肝癌组织中p53均低表达。在三种细胞系中检测,发现miR-1228在肝癌细胞QGY-7703和HepG2中高表达,在正常干细胞L02中低表达,而p53则呈相反趋势。过表达p53挽救实验表明p53可以削弱由miR-1228引起的对细胞生长及转移能力的异常增高。结论:首次发现miR-1228可以与p53形成正证反馈调控环路,并促进肝癌细胞的转移和增殖,扮演癌基因的角色。p53可以通过生负性调控这个抑制p53本身表达的micrRNA miR-1228,从而增强其抑癌基因的功能。