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本研究在原代培养的乳鼠心肌细胞，观察不同浓度瘦素对血清剥夺诱导心肌细胞凋亡、细胞活力以及过氧化指标的影响，并初步探讨其作用机制。结果显示：瘦素(5×10)可抑制血清剥夺诱导的心肌细胞凋亡，提高细胞活力及SOD活性，抑制过氧化产物丙二醛的产生，降低血清剥夺所诱导的心肌细胞caspase 3 mRNA过表达，提示瘦素对血清剥夺引起的细胞损伤具有一定的保护作用，瘦素抗凋亡作用可能与降低caspase 3表达有关。
瘦素是由167个氨基酸残基组成的蛋白类激素，由肥胖基因编码，主要由脂肪细胞分泌。1994年Zhang Y等从遗传性肥胖小鼠(ob小鼠)的脂肪组织中首次克隆出小鼠的肥胖基因。1995年Lsse N等成功克隆了人的肥胖基因，该基因编码的产物被命名为“瘦素”。瘦素具有调节物质与能量代谢、调节炎症与免疫反应、调节神经内分泌及心血管活动等多种生理功能。如增加一氧化氮合酶活性、刺激一氧化氮产生、降低细胞内游离钙离子的释放以及稳定血管内皮屏障功能等。Carlyle报道连续七天给大鼠静脉输注瘦素(1ug/kg/min)造成平均动脉压升高及心率增快，这些效应可被a与B肾上腺素能受体拮抗剂完全阻断，提示瘦素可能在高血压、交感神经活性以及肥胖之间起桥梁作用。此外，Xu等人报道瘦素可促进原代培养的心肌细胞肥大。肥胖及多种心血管疾病病人血浆瘦素含量明显升高，因此研究瘦素与心血管疾病发生中的作用与机制具有重要意义。
细胞凋亡是细胞内特定的自杀程序启动后引起的细胞程序性死亡过程。心肌细胞的凋亡是心脏疾病发生发展的重要机制。心肌细胞为终末分化细胞，通常不分裂增殖，凋亡将使心肌细胞数量不可逆地减少，从而造成心血管系统疾病及临床综合症的发生发展。然而，心肌细胞凋亡发生的确切机制尚未明了，阻止心肌细胞凋亡也是尚未解决的难题。
Erkasap等报道，瘦素(3000ng/ml)预处理原代培养的乳鼠心肌细胞5小时，可明显减少缺氧所致乳酸脱氢酶和肌酸激酶的释放，提示瘦素对缺氧造成的心肌细胞损伤具有保护作用。Lee等给MHC<,a>-ACS转基因小鼠静脉注射瘦素转染腺病毒引起高瘦素血症、cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化增强，从而增加脂肪酸氧化分解、减少脂肪堆积，保护心脏免受脂肪毒性损害，对心肌起保护作用。此外，在瘦素缺陷的Ob/Ob小鼠以及瘦素抵抗的db/db小鼠存在随年龄进行性发展的左心室肥大，给予补充瘦素后可逆转肥大、改善代谢异常。
本课题在血清剥夺诱导原代培养的乳鼠心肌细胞凋亡模型，应用MTT法检测心肌细胞活力、Hoechst33258染色法观察心肌细胞核凋亡形态、Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)双染流式细胞术测定细胞早期凋亡率等方法观察瘦素对血清剥夺诱导的心肌细胞凋亡的影响，应用Real time PCR检测心肌细胞中caspase 3 mRNA的表达变化，探讨瘦素在心血管疾病发生中的病理生理学意义。
实验方法与统计学处理
一、原代乳鼠心肌细胞培养取出生1-3天的SD乳鼠，无菌条件下取出心室肌，剪成1mm<3>碎块。以0.2％的胰蛋白酶液于37℃分次振荡消化，离心收集细胞，预贴壁2h以纯化心肌细胞，接种于不同规格培养板中，置于5％CO<,2>、37℃孵育，24h后换成含20％小牛血清和0.1mmol/L BrdU的DMEM培液，继续孵育48-72h后进行实验。
二、实验分组细胞培养至第3天，换无血清DMEM继续培养24h后随机分组：
①血清培养组(10％NBCS)：以含10％牛血清DMEM培养细胞；
②血清剥夺组(48h SD)：细胞以无血清DMEM培养48诱导凋亡；
③瘦素处理组：5×10<-9>与5×10<-8>mol/l瘦素+无血清DMEM培养细胞48h。
三、检测方法
应用MTT法测定心肌细胞活力；作Hoechst 33258染色观察凋亡的心肌细胞核的形态变化并计数；Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测细胞早期凋亡率及细胞存活率；硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量；SOD活性测定；Real time PCR检测caspase 3 mRNA表达四、统计学处理数据以均数士标准差表示，多组间比较用方差分析，若差异显著，则进一步用Student-Neuman-Keuls test，以P<0.05判断为有统计学意义。
实验结果
1．血清剥夺培养48h后原代培养心肌细胞形态变化心肌细胞无血清培养48h后，与10％小牛血清培养组相比，细胞体积明显变小，胞体单薄，细胞之间间隙变大，搏动频率减慢(从正常状态下90次/分左右减至约20次/分)，甚至停止搏动，死细胞增多。
2．瘦素对血清剥夺48h后细胞活力的影响无血清培养48小时后，细胞活力显著降低，仅为血清培养组的27±13％。较高剂量瘦素(5×10<-8>M)处理组心肌细胞活力为血清培养组的47±13％，显著高于血清剥夺组(P<0.001)，但仍低于血清培养组(P<0.05)。低剂量瘦素(5×10<-9>M)处理组活力为血清培养组的28±8％，与血清剥夺组比较，差异无统计学意义。该结果提示瘦素能提高血清剥夺培养后心肌细胞的活力。
3．形态学观察结果在荧光显微镜下，正常培养细胞核大小一致，荧光均匀，偶见固缩浓染核；Hoechst33258染色见血清剥夺组心肌细胞凋亡核明显增多，表现为：核固缩浓染，形状不规则，为颗粒、小块状，核碎裂现象增加。10％血清培养组凋亡百分比为10.66±2.89％(n=5)；血清剥夺48h组为24.84±5.84％(n=5)，显著高于血清培养组(P<0.01)；瘦素5×10<-8>M处理组为16.42±4.97％，显著低于血清剥夺组(P<0.05)，与血清培养组相比无显著差异；瘦素5×10<-9>M处理组为23.74±3.91％，显著高于血清培养组(P<0.01)，但与血清剥夺组相比无显著差异。
4．Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测结果结果显示：血清培养组心肌细胞早期凋亡率为15.36±2.54％，血清剥夺组为36.66±1.22％，显著高于血清培养组(P<0.001，n=5)；5×10<-8>M瘦素处理组心肌细胞早期凋亡率为24.44±2.5％，显著低于血清剥夺组(P<0.001)，但仍高于血清培养组(P<0.001)；5×10<-9>M瘦素处理组心肌细胞早期凋亡率为34.16±2.78％，与血清剥夺组相比无统计学意义(P>0.05)。血清培养组心肌细胞存活率为69.93±4.09％，血清剥夺组细胞存活率45.61±2.86％，显著低于血清培养组(P<0.001)；5×10<-8>M瘦素处理组细胞存活率为53.54±2.21％，明显高于血清剥夺组(P<0.01)；5×10<-9>M瘦素处理组细胞存活率为45.77±2.96％，与血清剥夺组相比，无显著性差异(P>0.05)。上述结果表明瘦素5×10<-8>M可抑制血清剥夺诱导的心肌细胞早期凋亡，并且提高细胞存活率。
5.瘦素对血清剥夺后细胞培养液上清中MDA含量、SOD活性的影响心肌细胞血清剥夺培养48小时后，不同剂量瘦素对细胞培养上清液中MDA含量的影响不同。血清剥夺48h组MDA含量为3.93±0.78nmol/ml，明显高于血清培养组1.9±0.34nmol/ml(P<0.001，n=5)；瘦素5×10<-9>M处理组MDA为3.37±0.38nmol/ml，明显高于血清培养组(P<0.01)，与血清剥夺48h组相比无统计学意义(P>0.05，n=5)，瘦素5×10<-8>M处理组MDA含量为2.1±0.26nmol/ml，明显低于血清剥夺组(P<0.001)，与血清培养组相比无显著性差异(P>0.05)。细胞培养液中SOD活性：血清剥夺48h组SOD为15.16±1.23 U/ml明显低于血清培养组21.94±1.34 U/ml(P<0.05)；瘦素5×10<-9>M处理组SOD为16.03±1.19 U/ml，明显低于血清培养组(P<0.05)，与血清剥夺48h组相比无统计学意义(P>0.05)，瘦素5×10<-8>M处理组MDA为19.78±0.23 U/ml，明显高于血清剥夺48h组(P<0.05)，与血清培养组相比无显著性差异(P>0.05)。以上结果表明瘦素可以增加细胞的抗氧化能力，提高SOD活性，减轻心肌细胞血清剥夺培养引起的过氧化损伤。
6.瘦素对血清剥夺后心肌细胞内caspase 3 mRNA表达的影响Real time PCR结果显示，心肌细胞血清剥夺培养48小时后，caspase 3 mRNA较正常血清培养组表达明显升高(P<0.05)。瘦素5×10<-9>M处理组caspase 3 mRNA与血清剥夺48h组相比无统计学意义(P>0.05)，瘦素5×10<-8>M处理组caspase 3 mRNA明显低于血清剥夺组(P<0.05)，与血清培养组相比无显著性差异(P>0.05)。结果表明瘦素可抑制血清剥夺诱导的caspase 3 mRNA表达，提示瘦素抗凋亡作用可能与抑制caspase 3 mRNA过表达有关。
结论：
本研究表明瘦素能抑制血清剥夺所诱导的培养心肌细胞凋亡，提高细胞存活率，提高SOD活性、降低MDA含量，减轻心肌细胞脂质过氧化损伤，瘦素抗血清剥夺所诱导的凋亡作用可能与抑制caspase 3 mRNA过表达有关。