锌是多种蛋白的辅酶,并参与催化生物体内的重要生化反应,是所有植物生长发育必需的微量元素之一。生物体为了维持细胞内适当的锌浓度以保证其正常功能而进化出了复杂的锌转运及其调控系统。植物体中55%～90%的锌是可溶的,维持着植物体多种生理功能,包括广泛参与了蛋白质、酶、碳水化合物、核酸、脂类、生长素的代谢及基因转录的调控等最基本、最重要的生化过程,锌也对细胞膜的功能和结构、自由基、细胞凋亡等有很大影响。助阳离子扩散蛋白(Cation Diffusion Facilitator,CDF)家族是一个推测参与阳离子转运的蛋白家族,对维持金属离子平衡和耐受起重要作用。目前为止发现,拟南芥CDF蛋白家族有12个成员构成,即AtMTPl-AtMTP12。这些成员定位在细胞各种膜系统,其中AtMTP5和AtMTP12推测定位于高尔基体膜上。AtMTP5、AtMTP12分别位于第三和第二条染色体上,编码含有351个aa和751个aa的蛋白质。结构分析表明,AtMTP5具有CDF蛋白家族的一些共同特征,例如,C端有一个CE结构域,N端有一段特殊的信号序列,含有6个跨膜区等。相比之下,AtMTP12基因不含内含子,氨基酸总长约是其他成员的两倍,拥有14个跨膜区,最终加工成两种蛋白质,这也预示了 在功能上可能存在的不同。本论文利用基因功能互补实验、克隆、植物分子遗传学等方法研究AtMTP5和AtMTP12可能的生理功能。主要结果如下:1、KAM3是一种缺失了重金属外排系统的大肠杆菌突变株,与普通大肠杆菌相比,其对高浓度Zn2+敏感不能正常生长。克隆AtMTP5基因的cDNA序列构建至原核表达载体pTrc99A上,通过KAM3功能互补实验结果表明,因描绘不同Zn处理结果,然后得出转入AtMTP5基因使KAM3菌株对高Zn2+更加敏感;2、将AtMTP5基因的cDNA序列构建至含有绿色荧光蛋白GFP基因的pEZS-NL载体上,在拟南芥原生质体中瞬时表达,共聚焦显微镜下显示出此蛋白定位于细胞的内膜系统上;3、组织化学染色发现,AtMTP5在茎和花中优势表达,幼嫩果荚中有微弱表达,莲座叶、茎生叶和根中几乎不表达或微量表达。这与抽取不同组织器官RNA,反转录后通过Quantitative Real-Time RCR定量检测表达结果一致。以此可知AtMTP5在地上和地下部分都有表达,共同发挥作用;4、为了研究AtMTP5、AtMTP12的生理功能,我们发现mtp5和mtp12单突变体在各种二阶金属离子胁迫下并无明显的表型,于是通过人工杂交的方法获得了mtp5/mtp12的纯合双突变体。野生型、T-DNA敲除突变体mtp5、mtp12和双突四种材料,同时在正常或二价离子胁迫平板上进行表型观察,结果表明:前三种材料在含不同Zn2+浓度的平板上没有较大表型差异,双突变体长势稍弱;在水培条件下,双突变体植物开花要明显晚于其它三个材料。5、进一步研究高锌胁迫下AtMTP5、AtMTP12的表达情况,我们抽取了高锌处理不同时间段的野生型拟南芥RNA,反转录后通过Quantitative Real-Time RCR定量检测,发现两种基因表达都受Zn2+诱导不同程度上调,且上调趋势一致。综上所述,本研究为进一步研究锌转运系统提供了新的线索,具有较高的学术参考价值和实践指导意义