Ca2+/H+反向转运体是一类跨膜转运蛋白，是Ca2+重要外向转运器，在植物的营养和信号转导中起着非常重要的作用。苹果是我国的重要果树，钙对苹果生长、果实品质、贮运性等方面具有重要的影响。苹果果实缺钙可导致苦痘病、水心病等成熟期和贮藏期间生理性病害，给我国的苹果生产造成巨大损失。　　 本文从‘长富6号’苹果中克隆了Ca2+/H+反向转运体基因-MdCAX1，比较了该基因与其它物种该基因的同源性，分析了该基因的结构；克隆了该基因的启动子序列，分析了启动子序列的调控元件的结合位点；研究了该基因的时空表达以及钙处理条件下的表达特性；借助于绿色荧光蛋白，对该基因基因的亚细胞定位进行了研究；构建酵母表达载体，运用酵母钙离子转运缺陷体(K667)，对该基因的功能进行了研究；构建植物双元表达载体，农杆菌介导该载体转化烟草，对该基因的功能进行了研究；构建果实特异启动子2A11控制的该基因的植物双元表达载体，转化番茄，为今后运用基因工程提高苹果品质，提供了理论依据。主要研究结果如下：　　 1、以拟南芥CAX1基因的序列为源序列在NCBI数据库中的苹果EST中进行同源搜索，获得100条同源序列，用DNASTAR软件中的SeqMan进行电子拼接，获得一段大小为1350bp的ORF编码区，将其命名为：MdCAX1。根据该序列设计一对特异引物，在‘长富6号’苹果cDNA中进行扩增，结果获得一条1350bp大小的特异条带。根据获得的ORF编码区，分别在其上下游设计两对巢式PCR引物，进行RACE，分别获得了一段大小为1168bp的和253bp的片段。去除编码区序列，获得126bp的5’UTR和402bp的3’UTR。将获得的cDNA序列及其推导的氨基酸序列在NCBI官方网站进行BLAST比对，发现其与网上公布的CAX基因及蛋白有较高的同源性，其中与豇豆的同源性最高，核苷酸同源性为75％，氨基酸为73％。此外结构分析表明，苹果MdCAX1蛋白同样具有CAX蛋白家族所共有的两个特殊结构：氮末端调节区(NRR)和钙结合区（CaD）。同源进化树分析表明：CAX蛋白家族可分为两大类，其中MdCAX1与同源性较高的VCAX1、CAX1和CAX3在亚分支聚为一类。　　 2、采用克隆MdCAX1全长编码区相同的引物，以‘长富6号’苹果的总DNA为模板，通过PCR扩增、测序，获得一条长度为3543bp的DNA序列，使用在线内合子分析软件Genscan，结合获得的该基因的ORF编码区，对该序列进行内含子分析，该基因DNA序列有10个内含子和11个外显子。Southern blotting分析表明，在苹果基因组里，MdCAX1基因可能有2-3个拷贝。根据克隆的MdCAX1基因DNA序列，在靠近5’端的外显子区反向设计两条巢式引物，以加了接头的‘长富6号’苹果的总DNA的酶切产物为模板，通过PCR扩增、测序，获得3条片段，长度分别为2362bp、888bp、573bp，经比对发现该三条片段为同一序列，只是长短不同。顺式调控元件分析表明：该启动子除了具有TATA-BOX5、光诱导元件、生长素调控元件、铜离子和氧诱导调控元件、赤霉素调控元件、光诱导元件、脱水和黑暗诱导元件、生物钟调控元件、水杨酸诱导元件、病原菌和盐诱导调控元件、磷缺乏调控元件和乙烯调控元件之外，还发现了两种与钙离子密切相关的调控元件：一种是钙离子响应元件，另一种是钙调素调控元件。　　 3、以‘长富6’号苹果为材料，应用荧光定量PCR的方法，研究了MdCAX1的时空表达规律及其对多种金属离子的胁迫反应，结果表明：MdCAX1基因在苹果果实中花后8周存在一个表达高峰，经过喷钙处理的同时期果实没有该表达高峰；在离体浸钙处理的果实中，经过六小时处理后表达量也出现了一个高峰；在叶片中，前期的表达量较高，6月4日后表达量开始下降；在茎、叶、花中都有较强的表达，尤其在是花中，表达量最高，而在果实的表达量很低；在钙离子和锰离子的诱导后，表达量较水处理对照有大幅度的提高。　　 4、构建了MdCAX1基因亚细胞定位载体以及该基因和其短截基因的酵母表达载体，研究了该基因的亚细胞定位和该基因在K667的功能。结果表明：该基因是一个定位在质膜上的跨膜蛋白，不管是原初的MdCAX1基因还是该基因的短截片段都可以互补K667的转运钙离子的功能。　　 5、构建了一种特殊的MdCAX1基因植物双元表达载体，可以通过常规PCR扩增，判断外源基因插入的拷贝数。通过农杆菌介导法将其转入到烟草K326中，获得了48棵潮霉素抗性苗，经过GUS染色检测后，获得4棵GUS阳性苗，分别命名为A、B、C、D。PCR、RT-PCR和Southern blotting检测表明：该4个株系均为阳性。PCR扩增检测拷贝数表明：株系A、C、D均为单拷贝，而株系B为多拷贝，Southern blotting检测拷贝数结果与PCR扩增检测一致。转基因烟草的4个株系中，株系C和株系D的钙离子含量显著高于对照，分别比对照提高了22.9％和13.58％,株系A的钙离子含量虽没有显著高于对照，但其含量也对照提高了12.8％，而株系B的钙离子含量与对照相比，显著低于对照中的钙离子量，比对照降低了13.1％。对于锰离子含量而言，4个转基因株系中，株系D显著高于对照，比对照提高了147.5％，而其它3个株系A、B、C都显著低于对照，分别为对照的75.3％、71.1％、83.7％。镁离子含量比较发现，株系A、B、C显著低于对照，分别为对照的86.3％、77.6％、73.4％，而株系D的含量与对照相当，为对照的100.5％，没有显著差异。　　 6、构建了该基因的番茄果实特异启动子2A11控制的植物双元表达载体p2A11::MdCAX1，将其转入到番茄中，获得了28个潮霉素抗性苗，GUS染色检测后，获得了4个GUS阳性株系，GUS阳性率为14.3％,PCR和RT-PCR进一步检测发现，该4个GUS阳性株系皆为阳性。转基因番茄表型观察表明，株系B株型矮小紧凑、腋芽分枝多，花蕾和复叶面积均比对照小，并且其开花期显著晚于对照，比对照迟49天，而株系C株型略低于对照，但其花蕾和复叶均比对照大。金属元素含量的测定表明，获得的部分转MdCAX1基因的番茄株系显著提高了Ca2+、Mg2+、Mn2+的含量，其中转基因株系C果实中的钙离子含量显著高于对照，株系D叶片中的钙离子含量显著高于对照；对于镁离子含量而言，4个转基因株系中，株系C果实中的含量显著高于对照，株系D叶片中的含量显著高于对照，在锰离子含量方面，株系D在果实和叶片均显著高于对照，尤其是在叶片中的含量，比对照高出10倍之多。