职业暴露石英所致矽肺和职业暴露炭黑所致炭黑尘肺是我国法定职业病。炎性反应在石英和炭黑暴露所致疾病过程中具有重要的作用。MAPK/AP-1信号转导通路参与了矽肺的发生发展过程,近年来研究发现,基因的表达不仅取决于基因本身,还取决于不改变基因序列的表观遗传修饰。DNA甲基化对矽肺患者MAPK/AP-1信号通路的调控,以及对该通路在炭黑暴露中的作用尚缺乏系统的报道。本研究分为两部分,第一部分以10例福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的矽肺患者的肺组织样本和2例正常的肺组织样本为研究对象,矽肺患者组分为初期矽肺(6例Ⅰ期矽肺患者)和晚期矽肺(2例Ⅱ期矽肺患者和2例Ⅲ期矽肺患者)且均不合并肺癌,采用Infinium450K芯片、免疫组化等技术,探讨了矽肺组织样本中全基因组甲基化水平的改变以及PTEN和c-Jun蛋白水平的变化。然后应用MS-RCR技术验证PTEN和c-Jun基因在人胚肺成纤维细胞(HELF)中的甲基化变化。结果如下：1.与GEO数据库中正常的肺组织甲基化数据相比,10例矽肺患者FFPE样本中全基因组DNA甲基化水平存在异常改变。早期组中,高甲基化位点6367(7.3%)、低甲基化位点80394(92.7%)；晚期组中,高甲基化位点13828(17.4%)、低甲基化位点65832(82.6%),均以全基因组低甲基化改变为主,而高甲基化位点主要分布在CpG岛,低甲基化位点则主要分布在其它位置。2. Infinium450K芯片中PTEN和c-Jun位点异常甲基化改变。Infinium450K芯片覆盖了63个位点与PTEN相关,其中53个与启动子区相关,25个位点与Jun相关,其中19个与Jun启动子区相关,19个位点与Fos相关,仅1个位点与Fos启动子区相关。按照P<0.001和|difference score|≥0.4的标准,早期组中,4个与PTEN相关的启动子位点发生高甲基化改变,未发现与Fos、Jun相关的位点有异常改变；晚期组中,10个与PTEN相关的启动子位点发生高甲基化改变,3个与Jun相关的启动子位点发生高甲基化改变,未发现与Fos相关的位点有异常改变。早期组中和晚期组中均未发现与PTEN, Jun和Fos相关的低甲基化位点。3. Infmium450K芯片发现早期组和晚期组存在着多个细胞信号通路的异常,同一细胞信号通路在早期组和晚期组中的敏感性不同。4.H&E染色结果表明,早期组的肺组织切片可见支气管和血管周围及其管腔内有大量炎性细胞浸润。晚期组中成纤维细胞、胶原纤维、尘细胞进一步增生,形成典型的矽结节。早期组中可见c-Jun和PTEN蛋白在肌成纤维细胞细胞质表达阳性,表现为棕黄色颗粒物,晚期组中PTEN和c-Jun蛋白呈阴性表达。5.HELF细胞中PTEN在各个时间点均出现了甲基化和非甲基化条带,c-Jun在3h和6h出现甲基化条带,甲基化条带在12h消失。本研究第二部分以HELF细胞为研究对象,采用Werstern blots蛋白印迹、显性失活突变体、电子扫描、荧光素酶检测以及免疫荧光技术,分析了炭黑和石英暴露对结缔组织生长因子(CTGF)的影响以及MAPK在炭黑诱导的细胞因子改变中的作用。研究结果显示：MTT实验结果显示：炭黑浓度在60～240μg/ml之间时,细胞存活率下降不明显,并且与之相对应的细胞存活率为65%-80%之间,所以后续的实验选用100μg/ml。电镜结果显示：HELF细胞内未观察到炭黑颗粒,但可以观察到石英颗粒。成功构建了转染CTGF siRNA的细胞模型(T-CTGF)。100μg/ml石英刺激HELF细胞12h和100μg/ml炭黑刺激炭黑24h可以引起CTGF水平增高。炭黑作用HELF后,可以引起ERK、JNK和AP-1的改变,并且通过ERK和JNK信号分子引起细胞因子IL-6和IL-8的改变,不依赖AP-1。结合本课题组的前期研究结果,石英可以引起MAPK/AP-1细胞信号通路的异常,可见MAPK在颗粒物暴露中有着重要的作用。