背景虫媒病毒(Arbovirus)是指通过吸血节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而传播疾病的一类病毒。虫媒病毒能在节肢动物体内繁殖,但对其不致病,经过一定的潜伏期,通过节肢动物叮咬脊椎动物传给新的宿主,并在新宿主体内繁殖,引起相应的临床症状。虫媒病毒呈全球性分布,主要分布于中温带、亚热带和热带地区,大多数具有地理分布特征。国际上已发现537种虫媒病毒,其中130余种可引起人兽疾病,许多虫媒病毒在全球范围内广泛流行并引起严重疾病,如登革病毒(DENV),乙型脑炎病毒(JEV),黄热病毒(YFV)等。虫媒病毒病已成为国际社会关注的公共卫生问题。山东省位于中国东部沿海,地处黄河下游,属于暖温带湿润和半湿润季风气候。人口密集,地质地理条件复杂,气候温暖湿润,适宜媒介昆虫滋生繁殖,形成了媒介昆虫种类的多样性,适宜多种虫媒病毒的存在与循环。但是,时至今日仅有流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis, JE)的病例报告,是否存在其它虫媒病毒病尚不清楚。而山东省部分地区夏秋季节存在不明原因发热和脑炎病例。为此需要开展山东省蚊传虫媒病毒与当地疾病关系的研究,为当地虫媒病毒疾病的预防控制提供依据。目的对山东省进行系统的蚊虫现场调查及蚊传虫媒病毒病原学研究,为当地虫媒病毒病的预防控制及夏秋季不明原因发热病例的诊断提供依据和信息。方法连续两年在山东省采集蚊虫标本,分类后,标本用液氮保存运送至实验室。蚊虫标本研磨后接种于组织细胞培养,阳性分离物使用血清学和分子生物学技术进行鉴定。对新分离病毒的特异性基因片段扩增测序后,使用ClustalX1.83、MegAlign、Mega4和Genedoc3.2等生物学软件进行核苷酸和氨基酸序列分析及系统进化分析。同时制备蚊虫标本核酸的cDNA文库,采用半巢式PCR法检测JEV核酸,使用PooledlnfRateManual软件计算蚊虫JEV感染率。结果1.本研究于2008～2009年连续两年在山东省7个采集点采集蚊虫标本,分别为山东省东部的烟台、青岛和东营,中部的淄博和济南以及西南部的济宁和菏泽。两年共采集到5属6种19211只蚊虫标本,包括三带喙库蚊、淡色库蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊、常型曼蚊和伊蚊。烟台、青岛和淄博以淡色库蚊为优势蚊种,淡色库蚊所占的比例分别为烟台2008年94.2%(1386/1471)2009年78.5%(992/1263),青岛83.3%(738/886),淄博89.2%(390/437)；济南、东营、菏泽和济宁以三带喙库蚊为优势蚊种,三带喙库蚊所占的比例分别为济南2008年67.2%(2050/3050),2009年100%(1400/1400),东营93.3%(2800/3000),菏泽99.6%(3950/3965),济宁87.2%(3260/3739)。2009年在烟台市采集的标本种类最多,采集到了除常型曼蚊外的所有5种蚊种。常型曼蚊只在济宁市采集到。2.通过组织细胞培养法对2008～2009年采集的蚊虫标本进行病毒分离。结果在242批蚊虫研磨上清中分离到33株病毒阳性分离物。血清学和分子生物学鉴定结果显示,21株分离物为乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),1株为盖塔病毒(Getah virus, GETV),1株为(Banna virus, BAV),10株为(Culex pipiens pallens densovirus,CppDNV)。基于E基因核苷酸序列的系统进化分析显示,山东省分离的21株JEV均属于基因Ⅰ型JEV,且存在明显的地域特征。21株JEVE基因核苷酸同源性在97.3%-100%之间,氨基酸同源性为97.2%-100%。与疫苗株SA14-14-2 E基因核苷酸同源性为87.2%-88.1%,氨基酸同源性为96.4-97.2。与JE减毒活疫苗SA14-14-2株在E基因区段存在11处共同氨基酸位点差异,但决定抗原性和毒力的重要氨基酸位点未发生变化。新分离GETV的3’UTR基因区段全长为401nt,存在GETV特有的长约53nt的3个重复序列元件和19nt的保守序列,第45-54nt间存在10nt缺失,与我国其它省份及蒙古和俄罗斯分离株一致。对新分离BAV基于第12片段的分子生物学特征分析,发现其与我国东北地区分离株(LN0688,LN0689)的氨基酸同源性最高,为97.6%。系统进化显示,山东省新分离BAV位于A1亚组,即位于中国北方分离组。10株CppDNV利用基于NS1和部分NS2基因进行测序分析,这些序列与中国辽宁,云南,新疆及贵州等省份的分离株(JZ-16;YN05217;XJ0545;GZWN1)的同源性均高于99%。3.对山东省蚊虫携带JEV的情况进行检测。在2008年采集的93批蚊虫标本中检出JEV核酸阳性34份,2009年采集的149批蚊虫标本中检出JEV核酸阳性18份。从地域分布来看,山东省东、中、西部蚊虫标本的JEV感染率均较高。分析不同蚊种JEV的携带情况,在三带喙库蚊、淡色库蚊、中华按蚊和伊蚊标本中均检测到JEV的核酸阳性。JEV平均感染率在20%左右。分别为24.3%(35/144),25%(1/4),20%(2/10)和17.5%(14/80)。本文还对各采集点蚊虫JEV病毒感染率与当地乙脑病例的流行分布进行了分析。结论本研究首次在山东省比较系统而全面地进行了虫媒病毒传播媒介的调查。采集到了5属6种蚊虫标本。证实了库蚊为当地的优势蚊种。从3种蚊虫标本中分离到了JEV.GETV.BAV和CppDNV等4种虫媒病毒。提示山东省存在多种适宜虫媒病毒循环的媒介蚊虫及存在多种虫媒病毒的循环。并在山东省多个地区,多个蚊种中都检测到了JEV的感染,提示山东省自然界中存在着高风险的JEV感染。