鸭源新城疫病毒的分离鉴定及共对SPF鸭免疫机能的影响

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鸭新城疫(Duck Newcastle disease)是由新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病,该病以呼吸道、消化道粘膜充血、出血或溃疡,出现扭头、转圈等神经症状为主要特征。传统理论认为新城疫病毒不感染水禽,即使感染也不发病(Bolte et a1.,2001),但1997年王永坤等首次报道从病鹅体内分离到该病毒后,安徽、山东、浙江、福建等地相继报道部分鸭群发生了新城疫(何永强等,2005;张太翔等,2009;陈少莺等,2004;张训海等,2001)。目前该病毒对鸭具有较强的致病性,已经成为危害我国养鸭业的重要疫病之一。   本研究2010-2012年在山东、江苏等地发病鸭场进行了病毒的分离鉴定,共分离到6株病毒。按常规方法进行血凝试验、血凝抑制试验,结果表明6株毒株均具有血凝特性,且血凝特性能被NDV阳性血清所抑制,而不被H9N2、H5N1、EDS-76阳性血清所抑制,初步鉴定6株病毒为NDV,分别命名为SD01株、SD02株、SD03株、SD04株、SD05株和JS01株。根据GenBank中发表的鸭源NDV F基因、HN基因序列,共设计合成了5对引物,采用RT-PCR的方法分别对6株病毒的F基因、HN基因核苷酸序列进行扩增和序列分析。结果表明:6株病毒F基因的核苷酸同源性为95.9%-99.9%,与F48E9和LaSota株的核苷酸同源性分别为85.5%-87.4%和83.1%-84.8%。HN基因的核苷酸同源性为97.0%-99.4%,与F48E9和LaSota株的核苷酸同源性分别为83.7%-84.4%和81.0%-81.5%。遗传进化分析表明6株病毒均为基因Ⅶd型,说明目前流行的NDV仍以基因Ⅶd型为主,且分离的毒株与传统疫苗株相比都存在较大的变异。F蛋白氨基酸序列分析表明,裂解位点的氨基酸组成均为112R-R-Q-K-R-F117,具有NDV强毒株的典型分子特征。   选用120只30日龄已免疫H5N1禽流感油乳剂灭活疫苗的SPF鸭,随机分为静脉注射组、点眼滴鼻组和对照组,每组40只。接种NDV后观察各组鸭的发病情况及症状,于不同时间随机剖杀试验组和对照组鸭,采集血液检测血液生化和血液常规指标,并测定鸭源NDV对SPF鸭外周血中淋巴细胞转化率和H5N1油乳剂灭活疫苗HI抗体效价的影响以及CD4+/CD8+的动态变化;采集脾脏、法氏囊,按常规方法制备石蜡切片、HE染色,观察病理组织学变化,TUNEL法检测脾脏、法氏囊细胞凋亡情况;以分析不同处理组鸭源NDV对SPF鸭免疫机能的影响。结果表明:攻毒后,试验组SPF鸭发病率为100%,死亡率为32.5%,并出现呼吸困难,肺脏出血,腺胃乳头出血等症状及剖检变化;血常规检测结果显示,鸭源NDV静脉注射组和点眼滴鼻组血液中RBC、HGB先降低后显著升高,PLT、WBC显著降低且均与对照组差异显著(P<0.05);血液生化检测结果显示,ALT、AST、LDH、CK、AMY活性升高而TP含量降低,静脉注射组和点眼滴鼻组与对照组相比差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);静脉注射组和点眼滴鼻组的H5N1油乳剂灭活疫苗HI抗体效价要比对照组低但差异不显著,淋巴细胞转化率与对照组相比降低且差异显著(P<0.05);静脉注射组与点眼滴鼻组的CD4+/CD8+变化趋势基本一致,均为先升高后降至正常水平以下;病理组织学病变以脾脏出血、坏死,法氏囊间质增宽、淋巴滤泡内淋巴细胞数量减少为特征;TUNEL法检测脾脏、法氏囊均出现细胞凋亡。因此,SPF鸭接种鸭源NDV后能引起免疫抑制。
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