二化螟(Chilo suppressalis(Walker))是禾本科作物上重要的钻蛀性害虫,广泛分布于亚洲、欧洲、大洋洲、非洲等多个国家,是我国水稻生产中危害最为严重的常发性害虫之一。γ-氨基丁酸(GABA)是动物中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质,其生成、运输、行使功能及分解等过程均通过GABA能神经通路完成。GABA能神经通路是三羧酸循环的重要分支;而GABA受体作为多种杀虫剂的分子靶标,在农业害虫防治中被广泛应用。本文首先基于二化螟基因组和转录组数据,通过分子克隆技术获得二化螟GABA受体GRD和RDL2亚基cDNA序列全长,并对GABA能神经通路其他基因的开放阅读框(ORF)序列进行了鉴定;然后利用RT-qPCR技术检测了GABA受体基因在二化螟不同组织和生长发育阶段的mRNA相对表达量;最后通过RNAi技术探究了 GABA能神经通路基因对二化螟生长发育的影响及相关基因干扰后试虫对杀虫剂的敏感性变化。1.二化螟GABA能神经通路基因的克隆、鉴定及生物信息学分析基于已公布的二化螟基因组和转录组数据,结合分子克隆技术,获得二化螟GABA受体GRD和RDL2亚基cDNA序列全长及GABA能神经通路中GAD1、GAD2、VGAT、GAT、GABAT等基因的ORF序列。从核苷酸和氨基酸水平对以上基因进行生物信息学分析,发现GRD、RDL2、GAD1、GAD2、VGAT、GAT和GABAT等基因的ORF分别包含1722、1491、1623、1530、1617、1824和1482个碱基(含终止密码子),并分别编码573、496、540、509、538、607和493个氨基酸残基。其中,我们对GRD基因进行了详细的分析,其蛋白分子量为65.12kDa,等电点为7.16,属于中性蛋白质;其N端和C端及中间部位约第300氨基酸附近形成了较强的疏水区和五个跨膜区;其与家蚕、黑腹果蝇、意大利蜜蜂、赤拟谷盗、灰飞虱及丽蝇蛹集金小蜂的GRD基因氨基酸序列同源性分别为76.20%、33.57%、38.00%、38.05%、35.17%和36.51%,并具有多个功能性保守域。2.二化螟GABA受体mRNA的时空表达谱研究通过RT-qPCR技术,测定了二化螟GABA受体亚基(RDL1、RDL2、GRD和LCCH3)基因在不同器官和生长发育阶段的mRNA相对表达量。结果显示,二化螟GABA受体基因mRNA在腹神经索中的相对表达量最高,头部次之,在中肠等其他器官中表达量相对较低;此外,随着二化螟龄期的增加,GABA受体基因的mRNA相对表达量逐渐降低,在六龄幼虫中相对表达量最低,而在成虫中相对表达量较高。3.RNAi对二化螟GABA能神经通路基因的沉默基于注射法,通过体外合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)对二化螟GABA 能神经通路基因(GAD1、GAD2、VGAT、RDL1、RDL2、GRD、LCCH3、GAT和GABAT)进行了干扰,结果表明干扰GAD1基因后试虫的生长发育受到影响,表现为发育迟缓、死亡;而干扰其它基因后,试虫正常生长,未观察到畸形或滞育等现象。通过RT-qPCR技术检测,发现RDL1和RDL2基因的mRNA相对表达量显著降低,在48h时分别降低43.0%和39.1%;室内毒力测定显示,对注射RDL1和RDL2基因dsRNA的试虫饲喂含有亚致死剂量氟雷拉纳(Fluralaner)的人工饲料后,试虫的死亡率显著降低,而饲喂含有亚致死剂量氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)的人工饲料后,试虫死亡率无显著差异;对注射其他基因dsRNA的试虫分别饲喂含有亚致死剂量氟雷拉纳或氯虫苯甲酰胺的人工饲料后,试虫死亡率无显著差异。体外构建异源表达GABA受体亚基基因(RDL1、RDL2、GRD、LCCH3)dsRNA的大肠杆菌菌株,并对一龄二化螟幼虫进行饲喂法处理,取食后的试虫表现出发育延迟、死亡现象,RT-qPCR检测发现其mRNA相对表达量显著降低。