奶牛乳腺炎是制约世界奶牛养殖业发展的重要疾病。该病主要由病原微生物（细菌、真菌、支原体等）黏附于乳腺组织引起，其临床治疗以抗生素疗法为主，因此这易引起的细菌耐药性增加，且抗生素残留严重威胁人类健康。中药毒性低、副作用小，用于临床治疗乳腺炎前景良好。　　靛玉红是青黛、大青叶等中药的主要有效成分，具有抗炎、抗肿瘤之功效，但因其水溶性差、生物利用度低、口服不易吸收等特性，临床应用受限。6-溴-靛玉红-3-肟（BIO，又称6BIO）是靛玉红的衍生物之一，抗癌功效与靛玉红相似，水溶性优于靛玉红。研究表明BIO对乳腺癌、膀胱癌的治疗有重要作用，但其对于乳腺炎的治疗效果尚未见报道。　　为研究BIO在治疗乳腺炎方面的作用，本研究构建了体外和小鼠体内乳腺炎模型，通过研究经BIO干预后，促炎因子、抑炎因子水平变化，评估BIO对乳腺炎的调节作用。通过进一步检测BIO对TLR4-NF-κB和TLR4-MAPKs通路的调控作用，确定BIO对乳腺炎的调控机制。检测细胞凋亡率、凋亡相关信号通路变化，确定BIO在炎症过程中抑制乳腺上皮细胞凋亡的机制，为BIO用于临床防控奶牛乳腺炎提供理论依据。主要研究结果如下:　　1.BIO试验浓度的确定　　乳腺上皮是乳腺的天然屏障，病原微生物或其分泌的毒素可通过损伤乳腺上皮细胞使其屏障功能丧失，造成乳腺损伤。乳腺上皮细胞是研究药物对乳腺影响良好的体外模型，本研究首先选用浓度为1、5、25、50、100、200、500、1000nM的BIO进行MTT实验，评价不同浓度BIO对小鼠乳腺上皮细胞(MMECs)活力的影响。结果显示浓度为1、5、25、50nM的BIO对MMECs生长无影响。随后通过qRT-PCR实验检测以上浓度的BIO对MMECs促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α转录水平的影响，结果显示BIO的浓度为5、25、50nM时对IL-6、IL-1β、TNF-α转录水平有极显著抑制作用(p＜0.001)，并且BIO浓度达到50nM时的抑制效果最显著，而1nM的BIO对促炎因子水平无影响。因此选择浓度为5、25、50nM的BIO进行后续研究。　　2.BIO抑制LPS诱致的MMECs炎性反应　　为探讨BIO对LPS诱导的MMECs炎症的作用，本研究用不同浓度的BIO预处理MMECs1h后再使用LPS刺激，以COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10作为MMECs炎性反应的判断指标，以其转录水平、蛋白水平的变化判断BIO对LPS诱导的MMECs炎性反应的影响。　　qRT-PCR及Western Blot结果显示浓度为5、25、50nM的BIO能够显著降低LPS诱导的COX-2转录水平和蛋白水平的表达(p＜0.001)，且呈现明显的剂量依赖性。qRT-PCR及ELISA结果显示BIO可抑制促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的转录和表达，其中BIO浓度为50nM时对IL-6、IL-1β、TNF-α的抑制效果最显著(p＜0.001)。而BIO可剂量依赖性的促进抑炎因子IL-10的表达。以上结果表明BIO可剂量依赖性下调COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达、上调IL-10的表达以抑制LPS诱导的MMECs的炎性反应。　　3.BIO抑制LPS对小鼠乳腺的损伤　　为探究BIO对LPS造成的小鼠乳腺损伤是否存在调控作用，本研究选用产后5-7d的昆明鼠为实验动物，以地塞米松作为治疗阳性对照，空白组、DMSO作为阴性对照，以BIO浓度为5，25，50μM小鼠腹腔注射。结果表明，各浓度BIO均可以减缓LPS诱致的乳腺红肿、充血，降低组织中炎性渗出，保护乳腺结构的完整性，BIO处理组乳腺炎性损伤综合评分显著低于LPS组(p＜0.001)，表明BIO对小鼠乳腺具有良好的保护作用。同时，BIO可以降低组织匀浆和血清中IL-6、IL-1β、TNF-α及MPO的表达,浓度为50μM的BIO下调作用最显著(p＜0.001)。上述结果表明BIO对LPS诱致的乳腺损伤有显著的保护作用，且该保护作用在所选浓度下具有一定的剂量依赖性，50μM保护效果最好。　　4.BIO抑制MMECs中TLR4-NF-κB及TLR4-MAPKs活性　　为进一步研究BIO抑制LPS诱致的小鼠乳腺损伤的机制，我们主要研究了BIO对天然免疫中发挥关键作用的TLR4-NF-κB和TLR4-MAPKs的影响。　　BIO对TLR4表达的影响:为深入研究BIO对TLR4的作用，我们使用TAK-242抑制TLR4后观察促炎因子TNF-α转录水平的变化，结果显示TAK-242抑制TLR4活性后，BIO对TNF-α转录水平剂量依赖性抑制的现象消失;同时qRT-PCR及Western Blot结果表明BIO可以显著抑制TLR4mRNA表达和蛋白表达(p＜0.001)。表明BIO可通过抑制TLR4活性抑制LPS诱导的炎症损伤。　　BIO对NF-κB表达的影响:NF-κB是重要的核转录因子，是调节天然免疫的关键节点，为研究BIO对其作用，我们使用qRT-PCR、Western Blot及免疫荧光的方法对其转录水平及磷酸化水进行检测。结果显示不同浓度的BIO处理均可以显著下调p65mRNA的表达(p＜0.001)，并通过抑制p65的磷酸化，从而抑制NF-κB的活性，发挥抑炎效果。　　BIO对MAPKs表达的影响:通过qRT-PCR结合Western Blot的方法研究BIO对MAPK家族三个主要成员JNK、ERK、p38的影响。结果显示BIO可以抑制JNK、ERK、p38的转录及蛋白水平表达，且BIO对MAPKs的抑制效果呈现明显的剂量依赖性，当BIO浓度为50nM时抑制效果最显著(p＜0.001)。　　该结果表明BIO可通过抑制MMECs中TLR4-NF-κB及TLR4-MAPKs活性控制LPS诱发的炎性反应。　　5.BIO抑制LPS诱导的MMECs凋亡　　为研究BIO对MMECs凋亡的作用，我们收集不同处理组细胞（浓度为5、25、50nM的BIO处理），通过流式细胞术对凋亡率开展分析;利用qRT-PCR及Western Blot对Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3和Caspase-8的mRNA水平及蛋白水平的变化进行动态监测。结果显示BIO能够降低LPS诱导的MMECs的凋亡率，抑制凋亡基因Bak和Bax的表达和凋亡相关蛋白caspase3和caspase8表达(p＜0.001)，促进抑凋亡基因Bcl-2及Bcl-xl的表达。表明BIO通过调节Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-xl等表达，调控Caspase3和Caspase8蛋白活性，抑制LPS诱导的MMECs凋亡。　　综上，本研究聚焦BIO对LPS诱导的小鼠乳腺炎的影响，证明BIO能够通过抑制TLR4-NF-κB和TLR4-MAPKs通路活性，下调IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2及MPO的表达，上调IL-10的表达，发挥抑炎效应。同时BIO可以抑制LPS诱导的MMECs凋亡。以上效应表明BIO可以降低LPS引起的乳腺组织损伤。由此，本研究为BIO用于临床治疗奶牛乳腺炎奠定了理论基础。