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研究目的糖尿病肾病以早期持续增加的微量白蛋白尿和晚期进行性肾小球滤过率(GFR)的下降为主要特征。研究发现控制蛋白尿的排泄与肾脏的预后有着紧密的联系,而足细胞损伤在糖尿病患者蛋白尿发生中起到重要作用。因而,以足细胞为研究对象进行糖尿病肾病研究具有特殊意义。血管生成素样蛋白4(Angiopoietin-like protein,ANGPTL4)是隶属于血管生成调节蛋白超家族的一种分泌蛋白,在氧化代谢、血管发生、细胞分化及肿瘤转移等方面具有重要作用。最近有研究发现,在足细胞相关肾病中,肾小球足细胞分泌的ANGPTL4增加;此外,ANGPTL4转基因大鼠表现为足细胞受损并且产生蛋白尿,提示ANGPTL4可以诱导机体发生肾小球病变并且导致蛋白尿。然而,ANGPTL4对足细胞的具体损伤表现及其进一步导致蛋白尿的具体机制尚不清楚。本研究拟通过动物实验和细胞基础实验探讨,在高糖情况下,ANGPTL4对足细胞细胞骨架及其功能调控中的作用及可能的调控机制,并为以ANGPTL4为靶点,研究糖尿病肾病预防和治疗的有效途径和新的药物靶点提供理论和实验依据。研究方法动物实验:STZ尾静脉注射诱导2型糖尿病大鼠模型,12周时选取正常对照组大鼠(10只),DM组大鼠(5只),检测血糖、24小时尿微量白蛋白,并进行组织形态学观察高糖下肾小球病理学改变,免疫荧光染色观察ANGPTL4在肾小球中的定位,western blotting检测肾脏ANGPTL4及相关蛋白表达改变。细胞实验:(1)足细胞同步化后分成:正常糖浓度组(5.6mmol/L葡萄糖),高糖浓度组(30 mmol/L葡萄糖),继续观察培养48h后,应用鬼笔环肽染色标记细胞骨架,观察高葡萄糖浓度对人足细胞细胞细胞骨架的影响。并且收集蛋白及RNA,q PCR检测足细胞ANGPTL4表达改变,western blotting检测人足细胞ANGPTL4及相关蛋白表达改变。(2)高糖刺激时间梯度,检测高糖状态下人足细胞系ANGPTL4蛋白表达及分泌随时间的变化。(3)应用人重组ANGPTL4蛋白对足细胞进行孵育,PI/Hoechst及caspase 3检测选取ANGPTL4适宜浓度。足细胞同步化后予以对照抗体及ANGPTL4或整合素α3β1中和抗体处理2h后,予以人Angptl4重组蛋白100ng/ml,Western blotting检测ANGPTL4、caspase3蛋白表达改变,鬼笔环肽染色观察ANGPTL4蛋白对人足细胞细胞细胞骨架的影响。研究结果动物实验(1)SD大鼠一般资料显示,糖尿病组的血糖、24小时尿白蛋白均较对照组显著增加(P<0.001),肾重/体重也明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。(2)HE染色结果显示,2型糖尿病肾病大鼠肾小球体积增大,系膜细胞及基质增生,肾小球毛细血管袢呈分叶状。免疫组化显示,糖尿病组大鼠肾小球的纤维连接蛋白表达明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。电镜显示糖尿病组大鼠肾小球足突排列较为紊乱,有足突融合或者足突脱落现象,与正常对照组大鼠相比较,其肾小球基底膜显著性的增厚(P<0.05)。(3)免疫荧光染色显示糖尿病组肾小球区域WT-1及Synaptopodin的荧光强度较正常对照组显著降低。在糖尿病组肾小球WT-1阳性细胞较对照组明显减少,Synaptopodin阳性区域缺损,提示足细胞受到损伤。(4)免疫荧光染色显示ANGPTL4在肾小球足细胞中有表达,糖尿病组大鼠肾小球ANGPTL4荧光强度较正常对照组显著升高(P<0.05)。Western blotting检测显示,与对照组相比较,糖尿病大鼠肾脏ANGPTL4蛋白表达明显增加(P<0.05),FAK、MAPK激活。细胞实验(1)人足细胞在30mmol/L葡萄糖培养48h后,可见细胞内ANGPTL4 mRNA表达增加(P<0.05),ANGPTL4蛋白表达下降(P<0.05),足细胞凋亡增加、细胞骨架受损。(2)高糖分别刺激足细胞6h、12h、24h、48h和72h,在24h内,足细胞表达ANGPTL4蛋白随着刺激时间延长而增加(P<0.05),当刺激时间大于24h时,足细胞内检测到的ANGPTL4蛋白含量明显降低(P<0.05),此时足细胞分泌的ANGPTL4明显增加(P<0.05)。(3)人重组ANGPTL4蛋白0、10、50、100和1000ng/ml孵育人足细胞,随ANGPTL4蛋白浓度增加,足细胞凋亡百分比增加(P<0.05),凋亡蛋白active caspase3/pro-caspase 3比值增加(P〈0.05)。人重组ANGPTL4蛋白100ng/ml时,对足细胞的作用与葡萄糖30mmol/L相当。(4)采用ANGPTL4中和抗体可以降低active caspase 3/pro-caspase 3比值,改善高糖导致的足细胞细胞骨架损伤(P〈0.05);采用整合素α3β1中和抗体可以降低active caspase 3/pro-caspase 3比值,改善人重组ANGPTL4蛋白导致的足细胞细胞骨架损伤(P〈0.05)。研究结论(1)糖尿病大鼠肾脏存在足细胞损伤,ANGPTL4表达上调;高糖状态下,足细胞ANGPTL4表达上调,足细胞细胞骨架受损,足细胞凋亡增加。(2)高糖通过ANGPTL4发挥致足细胞细胞骨架损伤及足细胞凋亡的作用。(3)ANGPTL4通过整合素与足细胞发挥作用。以ANGPTL4和整合素α3β1中和抗体可以拮抗高糖对足细胞的作用,可以以此为靶点研究新的糖尿病肾病治疗药物。