细胞在正常的生理状态和病理状态下都会不断的合成新的蛋白质来对周围环境的变化作出反应。但是由于所有蛋白质,包括新合成的蛋白和原有蛋白都是由20种基本氨基酸构成的,由于基本构成相同,这就很难让人们将新合成的蛋白质与原有蛋白区分出来。细胞靠改变蛋白表达量来对环境的变化与刺激做出反应。蛋白合成与分解,翻译后修饰,能够让细胞适应环境条件以及各种刺激的变化。因此,在生物学中,一个重要的工作就是比较两个或者多个生物系统中蛋白组成的变化,例如比较癌症与正常组织的蛋白组学差异,各种药物或者化学刺激下生物的蛋白质组学差异。新合成蛋白的发现,同样也能为我们提供一些重要的蛋白靶点。以质谱为核心的蛋白质组学已经成为了研究蛋白量表达变化以及蛋白翻译后修饰的主要工具。近些年,不断有新的生物化学与分析化学的方法建立起来。各种蛋白分离技术,如传统的一向与双向电泳(two dimentional electrophoresis,2-DE)技术和多维液相色谱技术(multi-dimentional protein identification technology, MudPIT)与质谱结合起来进行细胞和组织蛋白的鉴定。尽管转录后修饰,如磷酸化和泛素化修饰可以通过富集相应的磷酸化、泛素化蛋白来进行研究。然而富集和发现新合成的蛋白质就显得难度很大,因为所有蛋白,无论新合成的蛋白,还是之前就存在的蛋白都是由20种基本氨基酸构成的,并且这20种氨基酸在新,旧蛋白中都是一样的。通过特定的标记方法发现并且鉴定出在一定时间内新合成的蛋白是意义十分重大的,从中我们可以发现许多重要的刺激或者疾病靶点。鉴定出新合成的蛋白可以扩充比较蛋白质组的方法,并且能够让我们更加了解在特定细胞中蛋白质组的时间和空间的动态变化。化学分子标记(biochemical tagging)就是在这种需求下发展而来的一种可以高度特异的标记新合成蛋白质的一种·技术,常用的标记方法有用Homopropargylglycine (HPG)来标记新合成蛋白质。HPG标记技术的核心在于它利用了一种人工合成的化学分子HPG去替代正常的甲硫氨酸参与到蛋白质的合成当中,并且这种分子可以替代甲硫氨酸去完成正常的生理功能。由于HPG上带有一个alkyne基团,在HPG标记蛋白之后又可以再次在此小分子alkyne上高度特异的连接上一个外源的指示标签或者亲和标签。标记的过程完全依靠细胞内部本身的原料和转录与翻译功能的细胞器。带上HPG标记的蛋白就带上了alkyne基团,并且具有alkyne基团的性质。这样我们就可以把新合成的蛋白质从原有的,老的蛋白质中区分出来。在正常的生物体细胞中是不含有alkynes的,alkynes分子是一种十分稳定并且不会对生物体产生毒性作用的化学分子。并且alkyne可以和另一种化学分子azide发生反应,这种连接反应依赖于催化物质Cu2+离子的存在。这种Cu2+离子催化的连接反应是十分迅速并且特异的。运用这种铜催化作用下的alkyne-azide连接反应,HPG的alkyne基团可以与一个带有azide的荧光染料标签或者biotin-Flag标签连接起来,形成一个整体。通过这样的两步连接就可以使HPG带上一个荧光染料或者biotin标签。荧光染料的加入使新合成的蛋白示踪与定位成为可能,可以通过传统的电泳分离显示出来,或者在显微镜下进行生物图像定位研究。通过HPG对新合成蛋白的荧光标记,我们便可以找到相应的新合成蛋白并且鉴定出来。生物素标签的引入就可以使后续的亲和富集成为可能,方便了对带有HPG标记的蛋白质的分离和鉴定。通过HPG对新合成蛋白的富集,可以降低样品中蛋白的复杂性,从而提高对低丰度的新合成蛋白鉴定的可能性。甲硫氨酸是一种必需氨基酸,生物体不能靠自身合成,而需要外界的不断补给。HPG是一种非常有效的甲硫氨酸替代物,HPG并不需要任何的修饰与改变就可以被甲硫氨酸tRNA当成底物携带与运输并参与蛋白合成。用HPG标记蛋白质与用放射性同位素(S35标记甲硫氨酸与半胱氨酸)标记蛋白质有着许多相似处。但HPG一个明显的优点就是安全性好,无辐射,并且HPG加入蛋白质中并不会产生对生物体有害的毒性,并且并不会影响蛋白生成和降解的速率。通过加入HPG进行标记,经过示踪或者亲和纯化,许多功能上和结构上不同的蛋白质都能够被定位、富集并且鉴定出来。人们称这种由铜Cu2+催化的alkyne-azide连接反应为"click chemistry"。它能够在蛋白变性的条件下去标记蛋白,也能够在去污剂存在的条件下,比如SDS存在的条件下反应,这大大提高了蛋白的溶解性,并且提高了各种蛋白,如膜蛋白、可溶蛋白、酸性、碱性或者小分子量蛋白被成功鉴定出来的概率。当然,利用HPG标记技术来鉴定新合成蛋白也有一定的局限性,因为在此过程中,蛋白必须具有一个以上的甲硫氨酸才能够被标记上,在人类蛋白质组基因数据库中,有1.02%的蛋白是不含有甲硫氨酸的。还有5.08%的人类蛋白仅含有1个甲硫氨酸或者是在N段端含有甲硫氨酸,在N端的甲硫氨酸可能会在翻译后加工的过程中被去掉。去除这些不能或是不容易被标记的蛋白,人类蛋白至少有94%的蛋白是可以利用HPG标记方法来标记鉴定。2-DE是目前唯一可在一块胶上同时分离成千上万个蛋白质组分的方法,双向电泳由高分辨率的等电聚焦电泳和SDS-PAGE电泳联合组成。第一向为等电聚焦电泳,采用经典的两性电解质载体在电流作用下形成pH梯度,依据pI的不同进行分离,第二向为SDS-PAGE,按蛋白质分子量的大小进行分离。目前一般采用IPG预制胶条来进行第一向电泳,IPG由丙烯酰胺衍生物与聚丙烯酰胺共价聚合而成固相pH凝胶梯度,IPG形成的pH梯度稳定,聚集准确,消除传统IEF阴极漂移问题,显著提高双向凝胶电泳结果的重复性,并且增加了对低丰度蛋白质的分离检出率。2-DE结合银染、荧光染色或放射性标记等方法,目前已可分离到1000-3000个蛋白质样点,最多的甚至可达10000个以上,分辨率可达ng级。但2-DE也存在其固有的局限性：如某些过酸或过碱的蛋白,大分子量蛋白,溶解性不好的蛋白,膜蛋白由于很难进入胶条而在双向电泳的过程中丢失掉。并且双向电泳过程繁琐,难以自动化,高通量的操作。基于上述思考,本研究选用了HEK293细胞,对细胞进行饥饿处理,并且选取特定的时间周期在细胞培养基中加入了HPG培养,新合成的蛋白中就引入了HPG标记。之后进行click-chemistry连接上荧光标签。然后提取细胞总蛋白,并进行双向电泳分离,建立了相应的新合成蛋白质图谱。从中挑取带有荧光的蛋白点,就是我们要寻找的在特点时间,特定处理下新生成的蛋白质。对这些新合成荧光蛋白点利用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,共鉴定出26种蛋白质。并进行数据库搜索初步分析这些新合成蛋白的功能。通过研究,我们得出以下结果：1.首先通过几组时间梯度与标签浓度梯度的摸索,找到了合适的时间处理与标记浓度条件,优化了HPG标记新合成蛋白质的标记条件。2.利用HPG进行新合成蛋白的标记,通过加入蛋白合成抑制剂与实验组比较,确定我们试验中标记的的确为新合成蛋白质。3.摸索并优化了新合成蛋白质click-chemistry的反应条件,得到了满意的反应效率。4.摸索并优化处理新合成蛋白双向电泳纯化方法,并建立了相应的新合成蛋白质图谱。5.对相应新合成蛋白点进行质谱鉴定,去除角蛋白污染峰后,共鉴定出26种蛋白。6.通过生物信息学分析初步分析这些新合成蛋白质的作用。该研究方案能够成功的标记哺乳动物细胞HEK293的新合成蛋白质,并且利用双向电泳进行分离鉴定得到相应的新合成蛋白质组。这为我们在特定的生理周期和生理及外界刺激下找到相应的新合成蛋白质提供了理论基础,为深入了解生物体对于外界刺激的蛋白变化提供了新的机遇。此平台对于今后找寻新的疾病药物靶点也提供了新的方法。