器官移植是器官功能衰竭时有效的、有时甚至是唯一的治疗手段。该技术虽然自诞生以来取得了相当大的进展,但是移植排斥仍然是临床上器官移植所面临的主要问题和挑战之一。免疫抑制剂虽然可以有效地抑制排斥反应,延长移植物的存活时间,但会不可避免地导致机体免疫力下降,增加肿瘤和感染发生的危险。如果能够诱导受体产生供体器官特异的免疫耐受,则能从根本上解决移植排斥的问题,因而受到学术界的广泛重视。近年来的研究发现,表达于胎盘外层滋养层细胞上的非经典 MHC-I 类分子 HLA-G 能抑制子宫内局部 NK 细胞和 T 淋巴细胞的杀伤功能,是介导母体对胎儿的免疫耐受的重要分子。此外,在胸腺上皮细胞和肿瘤细胞上也存在着 HLA-G 蛋白的表达,它可能对于建立胸腺 T 细胞耐受和使肿瘤细胞逃脱免疫监控方面也具有重要的作用,是诱导机体产生免疫耐受的重要蛋白之一。这些发现无疑为器官移植耐受的基础研究和临床应用带来了新的希望。 本研究根据 HLA-G1 cDNA 序列设计并合成了 PCR 引物,以人肝细胞癌肿瘤组织总 RNA 为模板,应用 RT-PCR 技术,检测到肝癌组织中有高水平 HLA-G1mRNA 转录,并获得了其全长 cDNA,经核苷酸序列分析证实其与文献报道完全一致。本研究首次证实在肝细胞癌组织中同样有高水平 HLA-G1 表达,推测原发性肝癌的发生可能与高水平的 HLA-G1 所导致的机体免疫监督机能下降有关。 为了进一步研究 HLA-G1 的生物学功能,本研究将 HLA-G1cDNA 克隆入真核表达载体 pIRES2-EGFP,通过脂质体将其转染入人红白血病细胞系 K562,在荧光显微镜下观察到 EGFP 的表达情况,最后采用 G418(0.8mg/ml)筛选和 Westernblot 检测而获得稳定表达 HLA-G1 的细胞系 K562-G1。为了证实 K562-G1 表达的HLA-G1 具有生物活性,我们在体外采用 LDH 释放法进行了 HLA-G1 抑制健康人NK 细胞杀伤活性的实验研究。结果,在杀伤 16hr 后,当效应细胞:靶细胞分别为 80:1、40:1、20:1、10:1 时,实验组 NK 细胞对 K562-G1 细胞的杀伤活性为 17.6%、16.8%、15.2%和 14.7%,对照组对未转染的 K562 细胞的杀伤活性为 91.0%、85.3%、45.3%和 35.2%,对转染空质粒 K562-EGFP 细胞的杀伤活性为 89.3%、84.2%、36.5%和 32.1%。实验组 NK 细胞的杀伤活性较对照组 - 3 -<WP=8>博士学位论文 中文摘要明显降低(P<0.01),说明我们克隆的 HLA-G1 在体外获得了正确有效的表达并具有生物学活性。 虽然已有研究报道 HLA-G 可以在小鼠体内发挥免疫抑制作用,但是 HLA-G是否同样具有抑制大鼠免疫功能的作用尚不得而知。为了回答这一问题,本研究以 K562-G1 细胞为靶细胞,以受体 Wistar 大鼠外周血 NK 细胞和 T 细胞作为效应细胞,研究了 HLA-G1 在体外对大鼠 NK 杀伤活性及对 T 细胞免疫功能的影响。结果发现当效:靶分别为 80:1、40:1、20:1、10:1 时,实验组大鼠 NK 细胞对 K562-G1 细胞的杀伤率为 12.1%、11.6%、10.5%和 5.3%,对照组对未转染的 K562 细胞的杀伤率为 23.5%、20.3%、15.6%和 11.8%,对转染空质粒K562-EGFP 细胞的杀伤率为 24.5%、20.5%、14.9%和 10.6%;实验组 NK 细胞的杀伤活性较对照组明显降低(P<0.05)。当效:靶为 80:1 时,用单抗 MEM-G/9阻断HLA-G1分子,可以恢复NK细胞的杀伤活性,说明这一抑制效应是由HLA-G1介导的。淋巴细胞增殖试验发现 K562 和 K562-EGFP 可刺激 T 细胞增殖,而K562-G1 不会刺激 T 细胞的增殖(P<0.01);单向混合淋巴细胞培养结果表明K562-G1 能抑制淋巴细胞的增殖反应,与对照组相比抑制率达 48.9%(P<0.01)。上述研究首次证实 HLA-G1 同样可以在体外抑制大鼠 NK 杀伤活性,抑制 T 细胞的增殖,为研究 HLA-G1 在诱导大鼠肝脏移植免疫耐受中的作用提供细胞水平的依据。 腺病毒介导的基因转移在移植肝动物模型的研究中得到广泛应用。本研究将HLA-G1 cDNA 克隆入穿梭质粒 pTrack-CMV,与腺病毒骨架质粒 pAd-Easy-1 电穿孔共转化 E.coli BJ5183,利用高效的细菌内同源重组成功构建了包含目的基因HLA-G1 的重组腺病毒载体 pAd-HLA-G1,将其转染包装细胞 293 获得重组腺病毒 Ad-HLA-G1,经扩增、纯化后获得高滴度腺病毒 Ad-HLA-G1,体外感染小鼠肝癌细胞 Hepal-6,结果表明 Ad-HLA-G1 可高效感染 Hepal-6 细胞并正确表达HLA-G1,而且不影响该细胞的正常生长。这为研究 HLA-G1 在诱导大鼠肝移植免疫耐受中的作用奠定了基础。 本研究采用改良的“两袖套”法建立了SD-Wistar大鼠原位肝移植模型,病理组织学检测证实此模型的急性免疫排斥反应具有良好的稳定性,可用于肝移植免疫排斥反应的研究。在HLA-G1诱导肝脏移植免疫耐受的研究中,我们采用体外夹 - 4 -<WP=9>博士学位论文 中文摘要闭冷灌注法,在4℃保存液中以MOI为20:1的Ad-HLA-G1感染SD大鼠供肝,在4℃保存6hr后原位移植至Wistar大鼠。结果发现HLA-G1在移植肝内得到有效表达,实验组受体存活时间平均达14.67±1.37天,较空病毒组受体平均存活8.00±1.26天和空白对照组受体平均存