目的本研究旨在应用脱细胞技术,在彻底去除细胞的前提下,尽量保持细胞外基质的完整性,最大限度的保持其天然三维空间立体结构,成功制备出脱细胞脊髓支架,采用制备好的脱细胞脊髓支架与大鼠脊髓神经元细胞进行共培养,观察细胞在支架材料上的生长情况,为今后进行脱细胞脊髓支架移植治疗脊髓损伤提供了依据。方法1.取SPF级Wistar雌性大鼠10只,采用化学萃取法制备脱细胞脊髓支架。采用HE染色、髓鞘染色、扫描电镜观察脱细胞脊髓表面结构,将大鼠脊髓支架组织DNA提取,并进行DNA含量分析以明确大鼠脊髓支架是否成功脱掉细胞成分。2.取实验用幼年SD鼠2只,麻醉后取出脊髓组织并剪碎,置入装有细胞培养液的培养瓶中培养采用酶消化法对细胞进行分离纯化。细胞在体外增殖,传代后,对其用NSE免疫组化染色进行鉴定,并观察生长状况,绘制生长曲线。传至第2代后,将神经元细胞收集并与脱细胞脊髓支架共培养24小时,MTT观察细胞存活情况。3.将脱细胞脊髓支架消毒后修整为0.5cm的小段,取第三代大鼠脊髓神经元细胞共基培养。用倒置显微镜观察细胞生长情况,利用HE染色观察神经元脱细胞脊髓支架结合生长情况,利用NSE、NEUN染色鉴定共培养细胞是否为神经元细胞,利用扫描电镜观察整体空间三维结构。结果1.采用化学萃取法制备的大鼠脱细胞脊髓支架,Wistar大鼠脱细胞脊髓支架呈乳白色,半透明状,扁圆柱形,直径和长度均略微变短,质地柔软,韧性增大,无异味。HE染色、髓鞘染色显示大鼠脱细胞脊髓支架横切面上呈现大小不等的网孔状结构,细胞成分基本完全去除,未见细胞核蓝色颗粒和红色细胞质存在,轴突和髓鞘均已去除,网孔壁由均质粉红染色的细胞外基质构成,网孔内外均未见细胞残留,髓鞘扫描电子显微镜显示大鼠脱细胞脊髓支架呈不规则网孔状结构,细胞外基质呈层状排列,形成不规则圆形空腔,具备优秀的三维立体网孔状结构,孔壁较薄,表面积较大,孔洞间相互连通,经DNA琼脂糖凝胶电泳检测后未见DNA条带,大鼠脱细胞脊髓支架脱细胞完全,不含脱氧核糖核酸类物质,细胞已完全除去。2.制备的大鼠脊髓神经元细胞免疫组化NSE抗体染色结果显示细胞胞体呈棕褐色,细胞核呈蓝紫色,该细胞呈典型的神经元细胞形态,即所制备的细胞为大鼠脊髓神经原细胞。3.大鼠脊髓神经元细胞与大鼠脱细胞脊髓支架共培养后HE染色结果显示大鼠脊髓神经元细胞粘附于大鼠脱细胞脊髓支架生长,细胞生长状态良好。扫描电镜显示大鼠脊髓神经元细胞在三维通道中充分生长,形成聚集的细胞区域,不影响大鼠脱细胞脊髓支架空间结构,NEUN染色及NSE显示神经元细胞轴突生长状态良好,形态结构完整,说明大鼠脱细胞脊髓支架与大鼠脊髓神经元细胞具备良好的生物相容性与适应性。结论1.采用化学萃取法制备的大鼠脱细胞脊髓支架在彻底去除细胞的前提下,尽量保持细胞外基质的完整性,最大限度的保持其天然三维空间立体结构。2.将大鼠脊髓神经元细胞与大鼠脱细胞脊髓支架共培养,大鼠脊髓神经元细胞细胞生长状态良好,在脱细胞脊髓支架的空间通道中聚集生长,细胞轴突生长状态良好形态结构完整,并且脱细胞脊髓支架空间结构保存完整,大鼠神经元细胞在脱细胞脊髓支架中紧密排列,大鼠神经元细胞和大鼠脱细胞脊髓支架具备良好的生物相容性。