研究背景：众所周知,烟草类制品特别是香烟烟雾中含有大量的致肺癌化学物质,包括4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮[4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone,NNK],多环芳烃类(如苯并芘),重金属及各类复杂有机物等。在这些致癌物中,NNK是一种烟草特异性的N-亚硝胺类物质,虽然烟草中含有大量的致肺癌物质,但NNK在吸烟导致肺癌发生过程中起着关键的作用。大量研究表明,实验动物系统给予低剂量NNK,主要诱导肺腺瘤和腺癌发生。肺癌是目前世界上死亡率最高的肿瘤之一。大量流行病学研究表明大多数肺癌的发生与吸烟有着密切的关系。尽管我们在提高戒烟和改善肺癌病人的治疗方面做了大量的工作,但目前肺癌的5年生存率仍然较低(约15%),近30年来并没有明显改善。究其原因,缺乏有效的早期诊断肺癌的生物标志物是其中一个重要的原因。相关报道指出,有效的早期肺癌诊断标志物可能显著提高肺癌的5年生存率至50%左右。因此,探寻肺癌早期生物标志物对当前改善肺癌的治疗具有重要的意义。MicroRNA (miRNA)是一类约19-25个核苷酸的内源性的非编码RNA。通常在转录后负性调控mRNA的表达,参与多种生物学过程,包括肿瘤发生发展、细胞生长与增殖、凋亡及发育等。众多研究数据表明,在肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌及结直肠癌等多种癌症组织样本中均可检测到miRNA的表达异常,而且miRNA差异表达谱能有效分类不同类型的肿瘤。近年几个研究表明,循环miRNA对于多种癌症的检测是一种潜在的稳定的无创性的标志物。这些研究都一致性的表明循环miRNA是癌症的一种潜在的稳定的生物标志物。近来的几个研究表明,化学致癌物可诱导miRNA表达改变。雄性F344大鼠饮水中持续喂饲NNK20周可导致大鼠肺组织miRNA表达改变。据我们所知,迄今为止化学致癌物诱导循环miRNA表达改变的相关研究还少见报道。化学致癌物诱导癌症发生一般分为四个阶段：起始阶段、促进阶段、进展阶段和恶性转化阶段。而在NNK诱导大鼠肺癌发生发展各阶段,相关循环miRNA是否发生表达改变还不清楚。.因此,我们假设某些循环miRNA在NNK诱导大鼠肺癌发生发展过程中也发生了改变而且和NNK诱导肺癌发生密切相关。以往的研究表明,雄性F344大鼠对于NNK诱导肺癌发生是一种较敏感的实验动物,而且剂量反应关系显示低剂量的NNK持续处理主要诱导肺肿瘤发生,很少出现其他器官肿瘤发生。在本研究中,雄性F344大鼠持续给予NNK以诱导大鼠肺癌发生。利用这一动物模型,分别收集NNK处理第1、5、10、20、40、60、80和95周大鼠血液并分离血清运用小分子RNA Solexa测序方法检测血清miRNA差异表达谱,接着运用定量RT-PCR方法,检测大鼠个体血清中候选差异表达miRNA的表达情况,筛选出有意义的差异表达miRNA (miR-206和miR-133b)。进一步分析miR-206和]miR-133b在NNK诱导大鼠肺癌发生发展各阶段大鼠血清中的表达情况。为进一步鉴定miR-206和miR-133b作为肺癌标志物的潜力,我们分别检测了miR-206和miR-133b在大鼠肺癌组织、肺癌细胞系及肺癌人群血清样本的表达情况。以求探寻NNK诱导肺癌发生发展过程中潜在的有效的血清miRNA标志物,为肺癌的早期检测生物标志物研究积累重要的实验数据。并通过计算机生物信息学分析预测miR-206和miR-133b的靶基因及其功能,为进一步研究循环miRNA在化学致癌物诱导癌症发生过程的功能作用提供实验依据。研究目的：(1)雄性F344大鼠为实验动物,皮下注射低剂量NNK(每周3次,持续20周),然后常规喂养大鼠至95周以诱导大鼠肺癌发生,建立NNK诱导大鼠肺癌发生模型；(2)运用小分子RNA Solexa测序方法检测NNK处理组和对照组血清miRNA差异表达谱,筛选出候选差异表达miRNA;(3)运用定量RT-PCR方法,检测大鼠个体血清中候选差异表达miRNA的表达情况,筛选出有意义的差异表达miRNA (miR-206和miR-133b);(4)鉴定NNK诱导大鼠肺癌发生不同阶段血清中miR-206和miR-133b表达水平;(5)从大鼠血清,大鼠肺癌组织,肺癌细胞系及肺癌患者血清等多个水平鉴定miR-206和]miR-133b作为肺癌生物标志物的潜力,为探寻致癌物诱导肺癌发生的miRNA标志物研究积累重要的实验数据。研究方法：(1)NNK诱导大鼠肺癌模型的建立对照组大鼠皮下注射0.3ml生理盐水,NNK处理组大鼠皮下注射NNK溶液(1.15mg/kg,0.0055mmol/kg), NNK溶液每次注射前根据大鼠体重临用前新鲜配制,溶解在0.3ml生理盐水中,每周注射3次,连续20周,之后动物常规饲养于SPF实验动物房,至第95周剖杀。(2)大鼠血清小RNA Solexa测序在NNK处理第60周,分别从对照组大鼠和NNK处理组大鼠取等量血清混合,分别制备对照组混合血清和NNK处理组混合血清,送深圳华大基因公司进行小分子RNA Solexa测序,分析对照组和NNK处理组血清miRNA差异表达谱。(3)大鼠个体血清候选miRNA表达分析根据miRNA差异表达谱筛选出候选miRNA,运用实时定量RT-PCR方法,在第60周大鼠个体血清中鉴定这些候选miRNA的表达水平。确定显著差异表达的niRNA (miR-206和]miR-133b)。(4)NNK诱导肺癌发生不同阶段大鼠血清中miR-206和miR-133b表达分析运用实时定量RT-PCR方法,以miR-16为内参,分析第1、5、10、20、40、60、80和95周大鼠血清中miR-206和]miR-133b表达变化。(5)大鼠肺组织中miR-206和miR-133b表达分析运用实时定量RT-PCR方法,以RNUB6为内参,检测大鼠肺组织及肺癌组织中miR-206和miR-133b表达水平。(6)肺癌细胞系中miR-206和miR-133b表达分析运用实时定量RT-PCR方法,以RNUB6为内参,检测肺癌细胞系A549、QG56、H446、H1299、95-D及16HBE-T细胞中miR-206和miR-133b表达水平。(7)鉴定健康人和肺癌患者血清中miR-206和miR-133b表达水平。运用实时定量RT-PCR方法,以miR-16为内参,检测健康人和肺癌患者血清中miR-206和miR-133b表达水平。(8)生物信息学分析：为了预测miR-206和miR-133b在肺癌发生发展过程可能产生的功能作用,我们选择miRNA靶基因预测软件(http://www.microma.org/microma/)对miR-206和]miR-133b进行靶基因预测,并筛选出miR-206和miR-133b共同的靶基因,分析是否有些共同靶基因参与了肺癌或肿瘤的发生。另外通过网络计算机生物信息学资源http://acgt.cs.tau.ac.il/fame/index.html预测miR-206和miR-133b的功能。同时通过http://www.genome.jp/kegg/pathway/对miR-206和miR-133b参与调控的信号通路进行分析,以发现miR-206和miR-133b参与到的和癌症通路或非小细胞肺癌通路相关一些靶基因。(9)统计分析采用SPSS13.0统计分析软件进行相关统计学分析。用Shapiro-Wilk正态性检验进行各组数据的正态性检验。对于参数比较,两独立样本比较采用两独立样本t检验；配对样本采用配对样本t检验；多组样本比较采用单因素方差分析。对于非参数比较,两样本比较采用Mann-Whitney检验；多组样本比较采用Kruskall-Wallis检验。肿瘤发生率的比较采用Fisher’s确切概率检验；两变量的相关分析采用Spearman秩相关检验。为评价血清miRNA作为标志物的预测值,采用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic, ROC)分析评价其区分正常人与肺癌病人的能力。计量资料均表示为均数±标准差,所有统计分析均为双侧检验,设定P<0.05为具有统计学意义。研究结果：(1)NNK诱导肺癌动物模型的建立在NNK处理后第95周,对照组7只大鼠仅发现1个肺部肿瘤,NNK处理10只大鼠发现19个肺部肿瘤,对照组大鼠组织病理切片结果显示为正常肺支气管上皮细胞形态；NNK处理组肺肿瘤显示为中低分化的肺腺癌。比较对照组与NNK处理组肿瘤发生率分别为1/7和9/10,两组肿瘤发生率之间有显著的统计学差异(P=0.004)；两组间肿瘤大小比较也具有统计学显著性意义(t=6.286,P<0.001)。(2)血清miRNA差异表达谱387个已知的大鼠miRNA中181个miRNA在对照组和NNK处理组血清中能检测到。在对照组与NNK处理组血清之间82个miRNA表达具有明显统计学差异。与对照组血清相比,NNK处理组血清中,37个miRNA表达显著性上调；45个miRNA表达显著性的下调；99个miRNA表达在两组之间无统计学差异。在能检测到的181个miRNA中进行两组血清之间公共及特有表达的miRNA分析显示,20个miRNA特有性表达的在对照组血清中；8个miRNA特有性表达在NNK处理组血清中；其余153个miRNA在两组血清均有表达。(3)大鼠个体血清中候选miRNA表达分析对照组血清相比,NNK处理组血清中miR206(U=21.00, P=0.012), miR-133b (U=26.00, P=0.030)和miR-382(U=24.00, P=0.021)表达水平均显著性上调(Mann-Whitney检验)。MiR-365, miR-34c, miR-20a, miR-29b, miR-30e, miR-183, miR-331和miR-195在两组大鼠个体血清中表达水平未见显著性差异(P>0.05)。同时,我们对3个有显著性差异的miRNA (miR-206, miR-133b和miR-382)进一步分析发现,在大鼠个体血清中miR-206和miR-133b的表达水平具有明显的相关性,Spearman秩相关检验显示二者的表达水平呈明显的正相关,Spearman相关系数r=0.758,95%可信区间为0.339-0.926,P=0.003。(4)NNK诱导大鼠肺癌发生不同阶段血清miR-206和miR-133b表达分析相对于对照组血清,NNK处理组血清中miR-206和miR-133b表达水平在第1、5、10、20、40、60和80周均上调,miR-206上调倍数分别为1.43±0.11(t=-6.744, P=0.003);1.59±0.32(t=-3.215, P=0.032);2.17±0.35(t=-5.735, P=0.029);4.82±0.88(t=-7.497, P=0.017);3.23±0.99(t=-3.876, P=0.018);2.41±0.15(t=-16.250, P=0.004):1.85±0.12(t=-12.035, P=0.007):miR-133b上调倍数分别为1.08±0.10(t=-1.485, P=0.276);1.45±0.08(t=-9.208, P=0.011);2.12±0.25(t=-7.774, P=0.016);2.68±0.03(t=-97.887, P<0.001);2.33±0.17(t=-13.238, P<0.001);1.82±0.16(t=-8.953, P=0.001);1.30±0.16(t=-3.156, P=0.034)。可见在20周前大鼠血清中miR-206和miR-133b(?)目对表达水平呈上升趋势,在20周达高峰,之后其表达水平又逐渐下降。到第95周,相对于对照组血清,NNK处理组血清中miR-206和miR-133b表达水平下调,其下调倍数分别为2.09±0.64(t=5.769, P=0.004),2.78±0.30(t=26.813, P=0.001)。(5)大鼠肺组织及肺肿瘤中miR-206和miR-133b表达分析在9对NNK处理组肺肿瘤及其对应的正常肺组织中,相对于正常肺组织,在配对的肺肿瘤组织中miR-206和miR-133b均出现低水平表达,且差异均具有统计学意义(配对t检验)。同时我们检测了7只对照组大鼠肺组织中miR-206和：miR-133b的表达水平,采用单因素方差分析检验各组间的统计学差异,三组间miR-206(F=16.376, P<0.001)和miR-133b (F=11.001, P<0.001)表达水平具有显著性差异。如图3-16C和D所示,与对照组正常肺组织相比,NNK处理组中正常肺组织miR-206(P=0.001)和miR-133b(P=0.019)显著性低表达；在NNK处理组肺肿瘤组织中miR-206(p<0.001)和miR-133b (p<0.001)显著低表达。相对于NNK处理组正常肺组织,NNK处理组肺肿瘤组织中miR-206(P=0.048)和miR-133b (P=0.031)也显著低表达。(6)肺癌细胞系中miR-206和miR-133b表达分析相对16HBE细胞,肺癌细胞系A549, QG56, H446, H1299,95-D和16HBE-T细胞中miR-206表达水平分别下调28.341±3.435,97.638±16.922,33.999±11.882,33.055±16.138,23.424±3.899和31.688±12.306倍；相对于16HBE细胞,肺癌细胞系A549, QG56, H446, H1299,95-D和16HBE-T细胞中miR-133b(图3-12B)表达水平分别下调1.793±0.410,3.926±2.014,2.894±2.135,3.768±0.734,2.176±0.710和2.652±1.186倍。(7)肺癌和健康人血清中miR-206和miR-133b表达分析与健康人血清相比,肺癌患者血清中miR-206(图3-13A)和miR-133b(图3-13B)显著性低表达,差异具有统计学意义(miR206-U=61.00, miR133b-U=80.00, P<0.001, Mann-Whitney检验)。miR-206和miR-133b的ROC曲线分析结果显示miR-206和miR-133b ROC曲线下面积(Areas under curve, AUC)分别为0.9024(95%CI=0.8125-0.9923)和0.8720(95%CI=0.7734-0.9706)。(8)通过靶基因预测,人类miR-206和miR133b分别预测有7201和5314个靶基因,其中2577个基因是他们共同的靶基因。通过功能预测,我们发现miR-206参与了6个KEGG信号通路,包括VEGF信号通路、P53信号通路、烟酸和烟酰胺的代谢、囊泡转运的SNARE相互作用、谷胱甘肽代谢和嗅觉传导；；miR-133b参与了2个KEGG信号通路,包括Notch信号通路和脂质代谢。其中,P53信号通路和Notch信号通路与癌症发生密切相关。结论：(1)NNK处理第60周大鼠血清进行小分子RNA Solexa测序分析,结果.表明NNK处理可诱导血清miRNA表达发生改变。(2)通过大鼠个体血清中差异表达miRNA的实时定量分析,发现NNK处理组大鼠血清miR-206和miR-133b较对照组血清显著性高表达,而且血清miR-206和miR-133b的表达水平呈明显正相关；在大鼠肺癌组织,肺癌细胞系以及肺癌患者血清中,miR-206和miR-133b也呈现协同变化的关系,可能作为肿瘤抑制,niRNA参与NNK诱导的肺癌发生发展。(3)通过对NNK诱导大鼠肺癌发生发展各阶段血清中miR-206和miR-133b的实时定量检测,发现NNK处理组血清在早期呈上升趋势,在20周表达水平达高峰,之后逐渐降低,最后在第95周NNK处理组血清中呈低表达。(4)通过在大鼠肺癌组织,肺癌细胞系及有吸烟史的肺癌患者血清中进一步得以鉴定,发现血清miR-206和miR-133b是NNK诱导肺癌发生发展的潜在生物标志物。