研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,年发病率位居第五位,死亡率居第二位。由于肿瘤侵袭率高,容易肝内扩散,以及不适合标准的放疗和化疗等因素,晚期肝细胞癌患者的五年生存率低于10%。因此探索肝细胞癌发生发展的分子机制对采取有效的预防和治疗措施,进而降低发病率和死亡率至关重要。表观遗传学变异在人类癌症发生发展中扮演着极为重要的角色,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和RNA沉默等方式。近年来,RNA修饰成为表观遗传调控研究的新领域,其中,N6甲基腺苷化(N6-methyladenosine,m~6A)修饰是发生在腺嘌呤第六位N原子上的甲基化修饰,是真核细胞mRNA最常见、最丰富的化学修饰,由甲基转移酶复合体、去甲基酶以及相应的阅读器协同调控,对维持mRNA的稳定性、以及调节剪接和翻译等过程具有重要意义,参与肿瘤、生殖、生物节律等多种病理生理过程。甲基化转移酶3(Methyltransferase-like protein 3,METTL3)作为核心成分,与METTL14、WTAP共同组成m~6A甲基转移酶复合体,介导mRNA及LncRNA的m~6A修饰。已有多项研究证实,METTL3在白血病、恶性胶质瘤、肺癌、肝癌及乳腺癌等多种类型的恶性肿瘤中表达异常,并与患者的生存及预后密切相关。它在不同肿瘤中所起的作用并不完全一致。目前,METTL3介导的m~6A修饰在肝细胞癌发生发展过程中是否发挥作用尚不明确。本课题以METTL3为研究对象,探索它在肝癌组织中的表达水平和临床意义,对肝癌细胞增殖和迁移等生物学功能的影响,以及可能的下游作用机制,为进一步研究m~6A在肝癌发生发展中的作用通路提供前期实验数据,以期为肝癌的靶向治疗提供新的思路。研究方法1分析HCC中METTL3的表达水平及临床意义1.1利用TCGA数据库,分析METTL3在肝癌组织和正常肝脏组织,不同临床分期及病理分级HCC组织中的表达差异,并分析与患者预后的关系。1.2采用免疫组织化学方法检测肝癌组织芯片中METTL3表达水平,结合临床资料,验证与TCGA数据库分析结果的一致性。2检测METTL3对HCC细胞生物学功能的影响2.1选择HepG2和Huh-7两种HCC细胞,应用小干扰RNA(small interfering RNA,si-RNA)通过脂质体转染方式下调METTL3表达(siMETTL3组),与未转染细胞(siNC组)构成对照;2.2采用细胞克隆形成实验和CCK-8实验,检测各组细胞增殖情况;采用细胞划痕实验和Transwell实验,检测各组细胞迁移情况,明确METTL3的表达对HCC细胞增殖和迁移能力的影响。3推测METTL3下游调控机制利用TCGA数据库分析在HCC中与METTL3共表达的基因,进行GO生物学通路富集分析,结合既往文献报道,推测METTL3发挥上述作用的可能机制。研究结果1 HCC中METTL3的表达水平及临床意义1)TCGA数据库结果分析显示,HCC中METTL3表达量显著高于正常肝脏组织;Ⅲ期METTL3表达量显著高于Ⅰ期、Ⅱ期;Ⅲ级METTL3表达量显著高于Ⅰ级、Ⅱ级;METTL3高表达患者总生存期较低表达患者显著缩短,P均<0.05。2)免疫组织化学检测结果与上述结果基本一致。2 METTL3的表达对HCC细胞生物学功能的影响1)si-METTL3-1和si-METTL3-2组细胞中METTL3 mRNA及蛋白质表达水平较siNC组显著降低,转染效果良好;2)细胞克隆形成和CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell实验结果提示,与siNC组相比,si-METTL3-1和si-METTL3-2组细胞增殖和迁移能力显著增强。3 METTL3可能的下游调控机制METTL3与RBBP4表达呈正相关,而RBBP4可通过PTEN/AKT通路抑制HCC增殖、侵袭转移、和抗凋亡能力。结论1)m~6A甲基化转移酶METTL3在人肝癌组织中显著高表达;2)METTL3表达水平与肝癌患者的临床分期、病理分级和预后相关;3)METTL3促进人肝癌细胞增殖和迁移;4)METTL3可能通过METTL3-RBBP4-PTEN/AKT通路发挥上述作用。