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目的:感染性休克是一种以全身炎症反应为线索,细胞功能障碍,坏死为结果的休克。它可导致超氧阴离子及一氧化氮(NO)的产生增加。超氧阴离子与NO合成过亚硝酸盐(ONOO-),过亚硝酸盐可使细胞DNA的裂解,出现多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly (ADP-Ribose) Polymerase, PARP]的活化,PARP的活化可显著降低其底物辅酶I[Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD+]在细胞内的浓度,减慢糖酵解和电子传递的速度,从而减少三磷酸腺苷(ATP)的合成,这一过程将导致细胞功能障碍和细胞死亡。多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly (ADP-Ribose) Polymerase, PARP]结构:多聚(ADP-核糖)聚合酶是一种蛋白修饰酶及核苷酸聚合酶,在真核生物细胞核中含量丰富。多聚(ADP-核糖)聚合酶是分子量为116KDa的蛋白质。它的结果包括DNA结合N端区,中央自我修饰区以及C端催化区。这种酶的基本结构在真核生物中具有高度的保守一致性,其中人与鼠有92%的氨基酸序列具有同源性。在不同的物种,C端催化区同样显示了相当高的同源性。目前发现了PARP存在至少6个成员:PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4/VPARP、Tankyrase-1以及-2。最常见的亚型,就是PARP-1。休克时组织细胞缺氧的监测和及时纠正早已倍受临床医生重视,而且有确切证据支持通过早期积极增加全身氧输送可以改善患者预后。但是较多的研究发现在感染性休克晚期当组织细胞功能已经严重受损时,增加全身氧输送的治疗策略难以改善患者的预后。所以我们最想知道的是掩盖在全身血流动力学指标“正常化”之下,组织和细胞到底发生了什么变化?Trzeciak和Rivers把休克上述的改变归纳为:(1)全身性组织缺氧;(2)广泛性内皮细胞损伤(3)凝血系统活化(4)微循环和线粒体窘迫综合症(mircrocirculation and mitochondrial disress syndrome, MMDS)[2]。其中最受关注的两个问题,一个是以线粒体功能异常为核心细胞氧利用障碍,二、微循环功能障碍。PARP的过度活化是介导脏器组织损伤和器官功能障碍的一个关键终末效应机制,在线粒体功能障碍的发生机制中起到中心作用。PARP无论是在早期的器官功能障碍以及SIRS(Systemic Inflammatory Response Syndrome)所导致的多器官功能衰竭中,均起着至关核心的作用。大量的文献同样支持这个观点:在危重病人中,PARP是一个治疗干预的重要目标。在脓毒症及感染性休克中,亚甲蓝存在如下机制:(1)亚甲蓝通过可以通过抑制iNOS的活性从而减少NO的产生,并抑制NO发挥效应的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC) ,使环磷酸鸟苷(cGMP)降低,逆转休克时的心血管功能紊乱,避免异常释放NO。(2)在临床应用上也发现亚甲蓝在人体内可直接清除氧自由基,对组织细胞可提供多途径的保护作用和逆转细胞坏死的作用[6]。NO与超氧阴离子可迅速发生反应,生成过亚硝酸盐(ONOO-), ONOO-进一步酸化而发挥强大的氧化作用。目前已明确ONOO-病理损伤机制是与核酸作用而引起DNA的裂解,导致PARP的活化,PARP大量消耗NAD+ ,减慢电子传递和ATP形成的速率。PARP引起线粒体能量代谢障碍,导致细胞损伤甚至死亡。动物实验已发现ONOO-参与介导了中毒性休克、缺血再灌注损伤等危重病病理过程。亚甲蓝的作用机制就是减少NO的合成以及超氧阴离子的含量。因此从机制上可以从源头上,切断这条PARP的途径,从而达到改善组织细胞坏死的作用。本研究通过大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)复制脓毒症模型,探讨多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的表达以及以及亚甲蓝在Sepsis中作用机制的研究。目的是(1)通过研究多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly (ADP-Ribose) Polymerase, PARP]在Sepsis大鼠表达,以阐明多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的发生发展中所起到的作用。(2)Sepsis前应用亚甲蓝,以研究亚甲蓝对PARP表达及活性的影响。探讨亚甲蓝是否是通过干预PARP途径,降低PARP的生成,改善组织细胞的坏死。亚甲蓝作为一种价廉、多位点作用的药物,它对脓毒症的治疗有一定突破,但其确切作用机制尚需进一步明确。方法:本研究应用盲肠结扎穿孔法(Cecal Ligation and Puncture,CLP)复制脓毒症动物模型,选取清洁级、健康、雄性Sprague-Drawley大鼠30只,体重200-250g(河北医科大学实验动物中心)实验分组:30只大鼠随机分为3组,每组10只。I组:实验对照组(假手术组):只开腹翻动肠管,关腹,不结扎和穿孔盲肠,术前阴茎背静脉注射生理盐水0.8ml。;II组:脓毒症模型组:术前经阴茎背静脉注射生理氯化钠溶液0.8ml,注射后进行CLP手术;III组:亚甲蓝干预组:术前经阴茎背静脉注射10%亚甲蓝(15mg/kg、平均注射剂量为0.8ml),注射后进行CLP手术。术后18小时开腹观察腹腔炎症反应情况,分别留取肺下叶、小肠肠管、肾。实验方法:(1)免疫组织化学法:10%多聚甲醛固定24小时,脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,连续切片3μm厚。使用SABC法免疫染色。切片分别滴加抗大鼠PARP-1抗体(1∶200) 4℃孵育过夜。PPS洗片后,加羊抗鼠抗体,显色后。显微镜观察,每张标本切片取随机取样, PARP-1免疫染色评分直接计算每个视野下阳性细胞染色数目。(2)取每组大鼠小肠肠管,采用Western Blotting法检测PARP-1蛋白(分子量116000)定量。采用SPSS13.0版软件包(SPSS Company, Chicago,Illinois, USA)应用完全单因素方差分析对于Western blot结果进行统计学分析,比较三组PARP-1水平,P<0.05为差异有统计学意义。应用秩转换的非参数检验对于免疫组织化学法检测的结果进行统计学分析,比较三组PARP-1水平,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1实验对照组大鼠麻醉后清醒活动基本如常;脓毒症组大鼠术后有严重的脓毒症表现:动物术后苏醒延迟,逐渐出现精神萎靡、竖毛、寒战、呼吸急促,呼吸困难及眼角分泌物等表现,剖腹可见浑浊脓血性渗液、恶臭、肠管水肿、肝肾充血水肿,而亚甲蓝干预组动物术后表现较轻。2免疫组化结果:本实验对于三组大鼠的肾脏、肺脏、小肠进行PARP-1活性表达的监测。我们发现在3个组织中,PARP-1表达比较。实验对照组、亚甲蓝组、脓毒症模型组通过应用统计学秩转换非参数检验,三组之间存在统计学差异P<0.05。进行组组间的比较:实验对照组与亚甲蓝组及脓毒症模型组PARP-1表达存在明显差异(P<0.05)。亚甲蓝干预组与脓毒症模型组PARP-1表达存在明显差异(P<0.05)3 Western blot结果:PARP-1表达比较,实验对照组、亚甲蓝组、脓毒症模型组通过应用统计学方差分析,三组之间存在统计学差异F 291.89(P<0.05)。进行组组间的比较:实验对照组与亚甲蓝组及脓毒症模型组PARP-1表达存在明显差异(P<0.05)。亚甲蓝干预组与脓毒症模型组PARP-1表达存在明显差异(P<0.05)。结论:1本实验采用CLP方法可成功复制腹腔感染导致脓毒症大鼠动物模型。2通过免疫组化的方法,可检测到脓毒症、亚甲蓝组大鼠与实验对照组相比在小肠、肾脏、肺中PARP-1阳性表达较对照组明显增强。此说明在脓毒症大鼠中,在关键脏器中PARP-1阳性表达增强。此与文献中研究结果相同,且在国外文献的研究结果PARP-1在脓毒症中组织损伤坏死起到关键中心作用。而且亚甲蓝组与脓毒症组比较,在多脏器组织标本中,阳性表达有所下降。此说明亚甲蓝可以降低PARP的表达,达到改善多个脏器组织细胞坏死的作用。3通过Western blot可检测到亚甲蓝干预组与脓毒症大鼠组比较,PARP-1表达下降,且存在统计学意义。说明亚甲蓝应该是通过降低脓毒症大鼠超氧阴离子及一氧化氮(NO)的产生,降低亚硝酸盐的产生机制,从而进一步减少了PARP-1的生成,阻止组织细胞坏死。进一步加深了亚甲蓝在脓毒症中作用机制的进一步阐明。