当前,我国食品安全问题突出,生物性危害、化学性危害等问题严重。其中,最突出的化学性危害是贯穿整个农业产业链生产、加工和贮运全程的安全问题。现代社会的发展给人们带来丰富、高产的农产品的同时,种植和养殖业生产过程中不合理的使用农药、化肥、兽药,也带来了农产品中农药、兽药、违禁的饲料添加剂残留等超标,给人类健康造成危害。预防食品化学性危害的关键技术之一是建立快速检测方法。当前,快速检测方法主要采用酶学、免疫学等方法。这些方法的关键问题是要获得可用来检测的抗体。噬菌体抗体库表面展示技术（Phage Display Antibody Library）是利用基因工程技术发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术,与多克隆抗体和单克隆抗体相比,噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物,提供了不经免疫制备抗体的可能;而且它能够模拟抗体亲和力成熟过程,可通过链置换、PCR错配或随机致突变技术改变抗体亲和力,因此噬菌体抗体库表面展示技术在获得难以得到的抗体方面具有着巨大的潜力。近些年对制备化学物质抗体的研究种类很多,而利用噬菌体抗体库表面展示技术完成制备的报道少见。农药、兽药抗体制备技术平台的建设是标准抗体资源库和快速检测方法建立的基础和关键。而小分子的农药、兽药,由于本身没有免疫原性,常规方法很难获得理想的免疫效果,因此建立一种优化的新的技术体系,是获得高质量单克隆抗体的重要保证。本实验以盐酸克伦特罗为模型分子,探索利用噬菌体抗体库表面展示技术筛选化学污染物的单链抗体,建立小分子弱抗原物质抗体制备的方法,为进一步研究奠定基础。第一部分:以盐酸克伦特罗为靶抗原筛选噬菌体单链抗体盐酸克伦特罗（Clenbuterol,CLB）,俗名瘦肉精,是一种β2-受体激动剂,化学结构稳定,污染的肉食品,如猪肝中的盐酸克伦特罗要经过126℃油煎5min才能破坏一半,常规烹调对肉食品中CLB不起破坏作用。我国从1997年发文明令禁止使用“瘦肉精”。为了建立盐酸克伦特罗的快速检测方法,获得盐酸克伦特罗特异性抗体,我们采用噬菌体表面展示技术,以盐酸克伦特罗为固相包被抗原,将包被板处理后,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选过程,获得特异性较强的CLB单链可变区抗体。主要结果如下:1.从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,得到5株噬菌体抗体克隆。2. ELISA和竞争抑制ELISA结果证明其具有一定特异性。3.经NotⅠ/SfiⅠ双酶切后,证明得到的片段大小与预想目标片段大小一致。第二部分:以生物素化盐酸克伦特罗为靶抗原筛选噬菌体单链抗体每个链霉亲合素（Streptavidin,SA）分子具有4个可与生物素分子结合的位点,其结合常数为10¹⁵mol/L。约为抗原抗体间Ka (10⁵～10¹¹ mol/L)的1万倍以上。利用生物素具有结合亲和素、亲和力高的特点,以生物素标记抗原,再通过亲和素-生物素的架桥把抗原与抗体结合起来可以提高检测灵敏度,抗原分子经生物素化后,其结合抗体的活性不受影响。本部分实验利用生物素标记后的克伦特罗做为包被抗原,从噬菌体抗体库中筛选其特异性噬菌体单链抗体。为避免非特异性抗体的产生,设计两种方案进行实验。方法（1）,将生物素化靶抗原与链亲和素结合,直接从噬菌体抗体库中筛选特异性的噬菌体抗体;方法（2）,为排除非特异性结合抗体,将扩增的噬菌体抗体库悬液先与链亲和素、生物素作用,又采用①固相消减、②液相消减（比较可行性并摸索条件）做为筛选用的抗体库进行筛选生物素化CLB的噬菌体抗体。两种方法的主要区别在于消减方式上。从此抗体库中经过3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,获得了特异性较强的盐酸克伦特罗生物素化单链抗体。主要结果如下:1.方法（1）中,得到了5株噬菌体抗体克隆,ELISA和竞争抑制ELISA结果证明其具有较好的特异性。2.方法（2）中,采用固相（2-1）消减得到4株噬菌体抗体克隆;液相（2-2）消减得到5株噬菌体抗体克隆。ELISA和竞争抑制ELISA结果证明其具有较好的特异性。3 .经NotⅠ/SfiⅠ双酶切后,证明得到的片段大小均与预想目标片段大小一致。第三部分:盐酸克伦特罗特异性单链抗体在大肠杆菌中的表达目前,抗体有多种表达系统,如细菌、酵母和哺乳动物细胞,每种表达系统都有各自的优缺点。对于单链抗体,由于不需要糖基化,因此可以选用易于基因操作、成本低、繁殖速度快的大肠杆菌表达系统进行表达。本部分通过对比分析第一、二部分实验数据,得出生物素化CLB噬菌体抗体特异性好于未标记抗原所筛选出的单链抗体的结论,而且此方法能有效避免非特异性抗体的产生。因此确定一株特异性最强的噬菌体抗体克隆进行蛋白表达。主要结果如下:1.对比分析,确定一株噬菌体抗体“pHEN1-BHNS-CLB1”阳性克隆,进行蛋白表达。2.从噬菌粒“pHEN1-CLB1”切下scFv基因片段,亚克隆至可溶性表达载体pCANTAB5E上,构建重组质粒,将所构质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,命名“5E-BHNS-CLB1”。3.对获得的“5E-BHNS-CLB1”进行PCR及酶切鉴定并测序,结果表明片段大小与预想目的片段大小一致,GenBank收录号为EU681272。4.SDS-PAGE及Western blot的结果显示,表达蛋白分子量大小与预想一致,能与酶标抗E-tag标签抗体结合显色（说明表达的蛋白能与表达载体5E后带有E-Tag标签的短肽作用,含有E-Tag标签）,是我们要表达的目的蛋白。第四部分:对其它化学污染物单链抗体的筛选近年来制备化学污染物抗体的研究种类很多,而利用噬菌体抗体库表面展示技术完成制备的报道少见。农药、兽药抗体制备技术平台的建设是标准抗体资源库和快速检测方法建立的基础和关键。小分子的农药、兽药,由于本身没有免疫原性,常规方法很难获得理想的免疫效果,建立优化的新的技术体系,是获得高质量抗体的重要保证。我们利用噬菌体抗体库表面展示技术对化学污染物甲硝唑,氯菊酯,三聚氰胺,进行筛选。结果如下:1.利用第一部分的方法从半合成的噬菌体抗体库中对农药甲硝唑,兽药氯菊酯,以及三聚氰胺,进行3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,得到了三种化学污染物的单链抗体克隆共16株,ELISA结果和竞争抑制ELISA结果证明其具有较好特异性。2.利用第二部分方法,对生物素化的三聚氰胺进行3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,得到5株噬菌体阳性克隆,ELISA和竞争抑制ELISA结果也证明其具有较好特异性。