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研究目的:为探讨增液承气汤抗肝纤维化作用的物质基础及相关机制,课题首先提取中药复方增液承气汤中单味药(麦冬和玄参)和复方(麦冬、玄参、地黄和大黄)中多糖,观察增液承气汤中多糖对肝硬化小鼠的抗纤维化作用,同时观察对生化指标、免疫因子、内毒素(LPS)和肠道菌群的影响,以探讨增液承气汤中多糖抗肝纤维化作用与调节肠道微生态相关机制;课题还研究了麦冬多糖及其乙酰化衍生物的理化性质、结构特征和抗胰腺癌活性。该课题为基于多糖的增液承气汤质量控制和创新药物研究提供一定的理论和实验依据。研究方法:1.采用水提醇沉方法获得增液承气汤中单味药、复方药粗多糖;用40%四氯化碳(CC14)联合多因素法连续8周建立小鼠肝硬化模型。造模第6周开始,分别给予麦冬(0.5 g·kg-1)、玄参(0.5g·kg-1)、复方I(0.5g·kg-1)和复方II(0.8g·kg-1)多糖干预,连续治疗三周。肝脏HE染色和马松染色观察小鼠肝脏炎症以及肝纤维化程度,全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)等血清生化指标,酶联免疫吸附法检测小鼠血清白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等免疫因子和内毒素浓度,IlluminaMiSeq平台检测小鼠的肠道细菌多样性。2.采用酶联水提法提取麦冬粗多糖,用阴离子交换色谱法分离获得均一麦冬多糖,高效液相色谱法(HPLC)检测多糖纯度和分子量,通过红外光谱、核磁共振光谱、单糖组成、甲基化等物理和化学方法研究多糖的理化性质和微观结构。用吡啶-乙酸酐法制备乙酰化多糖,羟胺比色法测定乙酰基取代度,通过核磁共振光谱确定乙酰基取代位点。用MTT法检测乙酰化多糖的抗胰腺癌细胞增殖作用,荧光显微镜观察细胞核形态变化,蛋白质印迹法检测 caspase-3 酶、p53、p21、Bax 和 FASL 等的表达。研究结果:1.CCl4联合多因素作用8周后,肝脏组织HE染色,马松染色结果证明成功建立小鼠肝硬化模型。多糖治疗3周后,各给药组小鼠体重增高,较模型组活跃,肝脏炎症明显减轻,肝纤维化水平均较模型组低,同剂量下麦冬多糖组肝纤维化程度最低(p<0.01),复方II组纤维化水平降低明显(P<0.05)。模型组小鼠的肝脏系数较正常组显著降低(p<0.01),而麦冬、玄参、复方II组均升高(P<0.05),麦冬多糖组接近正常组。血清生化结果显示,模型组小鼠血清ALT、AST含量明显升高(p<0.01),麦冬、玄参及复方II多糖组血清ALT明显降低(p<0.01),各治疗组AST水平较模型组低(p<0.05);肝硬化模型组总蛋白、白蛋白组较正常组小鼠明显下降(p<0.05),而各多糖给药组的TP、ALB水平没有显著地升高,阳性对照组甚至较模型组低。与正常组相比,模型组的血清IL-1、IL-6含量显著增高(P<0.05),麦冬和复方II多糖治疗组血清IL-1浓度较模型组显著降低(p<0.05),复方II组低于复方I组,复方II组血清IL-6浓度明显降低(P<0.05);模型组的TNF-α水平较正常组高,治疗组除玄参多糖组较高外,其他治疗组的与正常组无显著差异。模型组小鼠血清内毒素浓度较正常组升高,而麦冬、玄参多糖治疗显著降低了血清内毒素含量(p<0.05),复方II组LPS含量较复方I组低(p<0.01)。模型组肠道微生物群结构出现变化,拟杆菌门、放线菌门细菌丰度显著减少(P<0.01),而厚壁菌门丰度增加(p<0.01);麦冬多糖组拟杆菌门、放线菌门菌群丰度较模型组升高(p<0.01),厚壁菌门丰度降低(p<0.05);玄参多糖组厚壁菌门显著降低(p<0.05);复方II放线菌门丰度增加(P<0.05),复方I放线菌门丰度高于所有组(p<0.01)。2.从麦冬中提分离纯化得均一多糖ROH05,重均分子量为16.7 kDa。经结构解析,ROH05是以1,4-β-D-半乳糖为主链,并在部分主链半乳糖的C-6与末端半乳糖相连。化学法制备乙酰化多糖ROH05A,乙酰基基取代度为0.23,乙酰基取代发生在1,4-β-D-半乳糖的C-2、C-3及C-6位和末端半乳糖C-6位。ROH05 A能显著抑制胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1的增殖,而对人正常肝细胞L02细胞毒性较小。荧光显微镜下观察ROH05A处理过的BxPC-3细胞,发现了凋亡的特征性细胞核破碎和皱缩;ROH05A可时间依赖性上调caspase-3蛋白水平表达,同时抗肿瘤基因p53、p21、Bax和FasL等的表达也上调。结论:1.成功建立肝硬化小鼠模型,用麦冬、玄参、低剂量复方、高剂量复方粗多糖干预,发现增液承气汤中多糖提取物能抗纤维化,改善肝硬化小鼠的ALI、AST等生化指标,降低肝硬化小鼠血清IL-1、IL-6等免疫因子和内毒素含量,调节肠道菌群失衡,其中,麦冬和高剂量复方多糖的治疗效果较好。本研究表明增液承气汤抗纤维化作用可能与调节肠道微生态、抗肝损伤及改善免疫功能有关。2.从麦冬中提取分离获得均一半乳聚糖ROH05,其主链为1,4-β-D-半乳糖,ROH05的乙酰化衍生物可通过诱导细胞凋亡抑制胰腺癌细胞增殖。课题意义:从活性多糖和肠道微生态角度探讨增液承气汤治疗肝硬化的作用机制,为增液承气汤的现代化制剂开发和抗肝纤维化化药物研究提供一定的理论和实验依据。对比研究发现麦冬多糖干预效果最好,进一步分离纯化麦冬粗多糖得均一半乳聚糖,发现其乙酰化衍生物具有抗胰腺癌细胞增殖作用,且作用机制与诱导癌细胞凋亡相关。多糖乙酰化衍生物的结构特征和抗胰腺癌研究,为乙酰化多糖构效关系研究及抗胰腺癌创新药物研发提供了理论依据。