目的：丙泊酚及氯胺酮现已广泛应用于临床麻醉与镇静。丙泊酚可直接兴奋GABAA(γ-氨基丁酸A)受体,抑制NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体;氯胺酮是非竞争性NMDA受体阻滞剂;NMDA受体NR2B亚单位的表达在大脑皮层发育过程中已达到了成年水平,被认为是中枢神经系统神经元功能性NMDA受体通道的重要组成部分;CaMKⅡα(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα)在脑内含量丰富,CaMKⅡ在突触传递(长时程增强和长时程抑制)、学习记忆等过程中具有重要作用。既往研究表明丙泊酚与氯胺酮具有诱导未成熟神经元死亡的效应,但它们诱导未成熟神经元死亡的分子机制如何尚需进一步探讨。本研究采用体外培养的未成熟大鼠皮层神经元,从形态学、细胞化学和分子生物学等多层面探讨:(1)本实验设计浓度的丙泊酚、氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚能够诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡;(2)在丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡的前提下,检测细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]I)及CaMKⅡα表达水平变化;(3)在氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡的前提下,检测NMDA NR2B受体及CaMKⅡα表达水平的变化。目的在于明确丙泊酚、氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡以及Ca2+-CaMKⅡα、NMDA NR2B-CaMKⅡα两条通路的变化,阐明丙泊酚、氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟神经元死亡可能的分子机制,为临床合理用药提供理论参考和实践指导的依据。　　 方法：　　 1、原代培养未成熟大鼠皮层神经元的细胞生物学鉴定选用健康清洁级Sprague-Dawley(SD)出生24小时内的乳鼠进行体外皮层神经元原代培养,体外培养第六天(DIV6)的大鼠皮层神经元应用β-Ⅲtubulin和NF-抗及选用FITC标记兔抗小鼠IgG和TRITC标记兔抗小鼠IgG二抗染色后,计数染色阳性神经元并计算阳性神经元百分数。　　 2、丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡选用健康清洁级出生24小时内的SD乳鼠进行体外皮层神经元原代培养,DIV6的大鼠皮层神经元暴露于丙泊酚(5μM或10μM或20μM)12h后,更换培养液,继续培养12h后,检测MTT、LDH及Caspase-3活性,应用PI与Hoechst33258复染方法计数死亡细胞。　　 3、Ca2+-CaMKⅡα通路在丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡过程中的变化选用健康清洁级出生24小时内的SD乳鼠进行体外皮层神经元原代培养,DIV6的大鼠皮层神经元暴露于5μM丙泊酚或10μM毒蝇蕈醇(GABAA受体兴奋剂)或5μM丙泊酚复合10μM尼莫地平(L-型钙通道阻滞剂)12h后,更换培养液,继续培养12h后,检测MTT、LDH及Caspase-3活性,应用PI与Hoechst33258复染方法计数死亡细胞,应用Fura-2/AM检测[Ca2+]I,应用Western免疫印迹分析技术检测CaMKⅡα表达水平的变化。　　 4、NMDA NR2B-CaMKⅡα通路在氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡过程中的变化选用健康清洁级出生24小时内的SD乳鼠进行体外皮层神经元原代培养,DIV6的大鼠皮层神经元暴露于1μM或10μM或20μM氯胺酮或20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚12h后,更换培养液,继续培养12h后,检测MTT、LDH及Caspase-3活性,应用PI与Hoechst33258复染方法计数死亡细胞,应用实时荧光定量PCRTaqman探针法检测NMDA NR2B亚单位mRNA水平变化,应用Western免疫印迹分析技术检测NMDA NR2B及CaMKⅡα表达水平的变化。　　 5、统计学分析所有计量资料数据以均数±标准差(mean±SD)表示,SPSS16.0统计学软件分析数据。数据经正态性和方差齐性检验,采用单因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05认为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1、原代培养未成熟大鼠皮层神经元纯度的细胞生物学鉴定β-Ⅲtubulin阳性神经元达到98.5％,NF阳性神经元达到97.7％。　　 2、丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡同对照组相比,5μM、10μM及20μM丙泊酚组呈剂量依赖性降低MTT(P＜0.05),增加LDH释放(P＜0.05),升高Caspase-3活性(P＜0.05),未成熟大鼠皮层神经元死亡数量随着应用的丙泊酚浓度的升高而增加。　　 3、Ca2+-CaMKⅡα通路参与丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡过程同对照组相比,5μM丙泊酚组MTT明显降低(P＜0.05),LDH及Caspase-3活性明显升高(P＜0.05),神经元的死亡数量明显增加(P＜0.05),而10μM毒蝇蕈醇组与5μM丙泊酚复合10μM尼莫地平组MTT、LDH、Caspase-3活性及死亡的神经元数量均无明显变化(P＞0.05);同5μM丙泊酚复合10μM尼莫地平组相比,5μM丙泊酚组MTT明显降低(P＜0.05),LDH及Caspase-3活性明显升高(P＜0.05),神经元的死亡数量明显增加(P＜0.05),而10μM毒蝇蕈醇组MTT、LDH、Caspase-3活性及死亡的神经元数量均无明显变化(P＞0.05)。　　 同对照组相比,5μM丙泊酚组与10μM毒蝇蕈醇组[Ca2+]I明显升高(P＜0.05);同5μM丙泊酚复合10μM尼莫地平组相比,5μM丙泊酚组与10μM毒蝇蕈醇组[Ca2+]I明显升高(P＜0.05);同10μM毒蝇蕈醇组相比,5μM丙泊酚组[Ca2+]i明显升高(P＜0.05)。　　 同对照组相比,5μM丙泊酚组CaMKⅡα表达明显上调(P＜0.05),而10μM毒蝇蕈醇组与5μM丙泊酚复合10μM尼莫地平组均无明显变化(P＞0.05)。　　 4、NMDA NR2B-CaMKⅡα通路参与氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡过程同对照组相比,10μM、20μM氯胺酮组及20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚组MTT明显降低(P＜0.05),LDH活性明显升高(P＜0.05)。　　 同对照组相比,暴露于氯胺酮的未成熟大鼠皮层神经元Caspase-3活性呈剂量依赖性增高(P＜0.05),20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚组Caspase-3活性是对照组的3倍之多(P＜0.05),是20μM氯胺酮组的1.2倍之多(P＜0.05)。同对照组相比,1μM、10μM、20μM氯胺酮组及20gM氯胺酮复合5μM丙泊酚组死亡神经元的数量明显增加(P＜0.05);同20μM氯胺酮组相比,20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚组死亡神经元的数量明显增加(P＜0.05),在20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚组,死亡神经元的数量约达40％。　　 同对照组相比,暴露于氯胺酮的未成熟大鼠皮层神经元NMDA NR2B mRNA的表达呈剂量依赖性降低,20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚组的未成熟大鼠皮层神经元NMDA NR2B mRNA的表达最低。Western免疫印迹实验则在蛋白水平证实了氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚下调未成熟大鼠皮层神经元NMDA NR2B受体的表达(P＜0.05)。　　 同对照组相比,1μM、10μM、20μM氯胺酮组和20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚组大鼠皮层神经元CaMKⅡα表达明显上调(P＜0.05)。同20μM氯胺酮组相比,20μM氯胺酮复合5μM丙泊酚组大鼠皮层神经元CaMKⅡα表达明显上调(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、DIV6的大鼠皮层神经元暴露于丙泊酚(5μM或10μM或20μM)12h,结果提示丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡。　　 2、丙泊酚通过GABAA受体和L-型钙离子通道介导诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡、升高[Ca2+]i并上调CaMKⅡα表达,即Ca2+-CaMKⅡα通路参与丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡过程。　　 3、DIV6的大鼠皮层神经元暴露于氯胺酮(1μM或10μM或20μM)或10μM氯胺酮复合5μM丙泊酚12h,结果提示氯胺酮诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡,氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡的效应更明显。氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡过程中下调NMDA NR2B受体表达并上调CaMKⅡα的表达,即NMDA NR2B-CaMKⅡα通路参与氯胺酮及氯胺酮复合丙泊酚诱导未成熟大鼠皮层神经元死亡过程。