老年性聋（Age-related hearing loss,ARHL）是指随着年龄的增长而逐渐发生的以高频听力下降为主的感音神经性听力损失,其患病率随着年龄的增长而增加,是当今世界上最常见的听力损失的原因,长期的听力损失不仅影响日常交流,还会导致老年人抑郁以及认知能力障碍等疾病。ARHL发病原因及机制复杂,目前缺乏有效的临床治疗手段。因此,明确老年性聋潜在的发病机制,探索新手段抑制其发展显的尤为重要。本研究拟以老年性聋（Age-related hearing loss,ARHL）患者血清、C57BL/6小鼠血清、C57BL/6小鼠耳蜗组织、耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞为研究对象,探讨PIN1（peptidyl-proplyl isomerase NIMA-interacting 1）及其相关信号通路在耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老中的作用及其可能机制,为进一步揭示老年性聋的发病机制,探索靶向治疗的方法提供实验依据。具体实验分为一下三部分:第一部分PIN1在ARHL患者血清、衰老小鼠血清和耳蜗中表达下调目的:观察并分析PIN1在ARHL患者血清、衰老小鼠血清和耳蜗中的表达情况及其与听力障碍的关系,初步探讨PIN1在老年性聋发病中的作用及意义。方法:1.收集临床ARHL患者以及健康者对照组血清,采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测人血清中PIN1蛋白以及氧化应激指标ROS、抗衰老蛋白Klotho的表达水平并分析与听力的关系。2.2月龄和12月龄雄性C57BL/6小鼠,每组6只,行脑干诱发电位（Auditory brain response,ABR）检测后,留取血后处死小鼠,收集双侧耳蜗。采用ELISA方法检测小鼠血清中PIN1蛋白以及氧化应激指标ROS、抗衰老蛋白Klotho的表达水平。β-半乳糖苷酶染色法检测各组小鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞的衰老情况。免疫组织化学和免疫荧光方法检测各组小鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞中PIN1的表达情况。结果:1.ARHL患者及C57BL/6小鼠的听力检测ARHL患者的听力是明显下降的,高频为甚。与2月龄小鼠相比,12月龄小鼠不仅在高频率的ABR阈值显著高于2月龄的小鼠,而且中低频率的ABR阈值也显著高于2月龄小鼠,提示12月龄小鼠的听觉功能明显下降。2.ARHL患者及老年C57BL/6小鼠血清中均出现PIN1、Klotho水平下降,ROS水平升高1)ELISA结果显示,与对照组相比,ARHL组患者的血清中ROS的水平升高,而抗衰老蛋白Klotho和PIN1水平降低。年轻对照组与老年对照组血清中ROS、Klotho和PIN1水平之间相比均无统计学意义。ARHL患者血清中ROS的水平与听阈值呈正相关,Klotho、PIN1的水平与听阈值呈负相关。2)动物实验显示,与对照鼠相比,老年C57BL/6小鼠血清中ROS水平升高、Klotho和PIN1水平降低。老年鼠血清中ROS的水平与听阈值呈正相关,Klotho、PIN1的水平与听阈值呈负相关。3.老年C57BL/6小鼠耳蜗中衰老细胞数量增加β-半乳糖苷酶染色结果显示,老年小鼠的螺旋神经节细胞（SGCs）和毛细胞（HCs）中与衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）阳性细胞多于年轻小鼠。4.在老年C57BL/6小鼠耳蜗SGCs及HCs中PIN1蛋白的表达降低IF和IHC分析表明PIN1蛋白的阳性表达定位于HCs和SGCs的细胞质及细胞核中。与年轻小鼠相比,老年小鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节中的PIN1表达明显下降。线性分析表明,PIN1在耳蜗中的表达与听力阈值呈负相关。结论:PIN1和抗衰老蛋白Klotho在老年性聋患者血清、老年C57BL/6小鼠血清中及老年C57BL/6小鼠螺旋神经节和毛细胞中表达水平降低,ROS表达水平增高,提示PIN1表达下降可能参与了老年性聋的发生。第二部分PIN1表达降低介导耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老目的:本部分以成年C57BL/6小鼠血清、耳蜗和HEI-OC1细胞为研究对象,通过上调或抑制PIN1表达,观察毛细胞衰老及听力改变,探讨PIN1在耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老中的作用。方法:1.为了探讨H2O2是否通过氧化应激诱导HEI-OC1细胞衰老以及对PIN1蛋白的影响,首先将细胞分别用不同浓度（0 m M、1 m M、2 m M、3m M、4 m M、5 m M）H2O2处理2 h,MTS法检测细胞存活率,并计算IC50,确定H2O2诱导HEI-OC1衰老的条件。采用免疫荧光方法检测PIN1蛋白的表达,Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53蛋白的表达,β-半乳糖苷酶染色方法观察细胞衰老情况。2.检测PIN1在H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老中的作用及可能机制。将常规培养的HEI-OC1细胞分为Control组、H2O2组、H2O2+OE-PIN1组和H2O2+NC组。Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53蛋白的表达,同时收集细胞进行β-半乳糖苷酶染色。3.不同浓度的胡桃醌处理常规培养的HEI-OC1细胞（1、5、10μm,45 min）,Western blot方法检测PIN1蛋白及衰老相关蛋白的表达,SA-β-Gal染色法检测细胞衰老情况。4.18只2月龄C57BL/6雄性小鼠,随机分为3组:正常对照组（n=6）,胡桃醌组（n=6）,溶剂对照组（n+6）。正常对照组不做任何处理,胡桃醌组每2天给予腹腔注射胡桃醌（1 mg/kg体重）,溶剂对照组每两天给予腹腔注射等剂量的溶剂（DMSO）,连续给药4周,进行ABR听力检测、留取血标本和耳蜗标本。5.ELISA法检测各组小鼠血清中的PIN1的水平。6.各组小鼠耳蜗毛细胞铺片,采用β-半乳糖苷酶染色法检测各组小鼠毛细胞的衰老情况。结果:1.H2O2对HEI-OC1细胞存活率的影响与Control组相比,在1、2、3、4、5 m M H2O2刺激细胞2 h之后,随着浓度增加,细胞存活率下降。IC50=1.17 m M,故选用1 m M的浓度刺激2 h为诱导HEI-OC1衰老的条件。2.H2O2可诱导HEI-OC1细胞发生衰老和PIN1表达下调1 m M H2O2持续刺激HEI-OC1细胞2 h,采用SA-β-Gal染色法观察细胞衰老。与对照组相比,H2O2组细胞中SA-β-Gal阳性细胞的百分比显著增加。此外,与对照组相比,H2O2显著上调了衰老相关蛋白p-p53、p21和p16蛋白的表达,而PIN1蛋白表达明显降低。3.PIN1过表达可抑制H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老与H2O2组相比,上调PIN1表达可降低H2O2诱导的p-p53、p21和p16的表达升高,同时PIN1过表达组中SA-β-gal阳性细胞的百分比也显著降低。4.PIN1抑制剂胡桃醌对HEI-OC1细胞PIN1及衰老相关蛋白表达的影响使用PIN1抑制剂胡桃醌后,细胞内PIN1的表达明显下降,而衰老相关蛋白p-p53、p21和p16的表达显著增高,SA-β-gal阳性细胞的百分比也明显增加。5.胡桃醌对C57BL/6小鼠听力及对血清中PIN1水平的影响与对照组相比,胡桃醌组小鼠的全频听阈值均有所提高,但以高频为主。ELISA结果显示,与对照组相比,胡桃醌组小鼠血清中PIN1水平显著降低6.胡桃醌可引起C57BL/6小鼠耳蜗毛细胞衰老在各组小鼠耳蜗的底转毛细胞中,胡桃醌组β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞多于溶剂对照组。结论:PIN1介导耳蜗毛细胞及HEI-OC1细胞衰老,过表达PIN1抑制HEI-OC1细胞衰老;抑制PIN1的表达导致听力下降和毛细胞及HEI-OC1细胞衰老的发生。第三部分PIN1下调通过PI3K/Akt/m TOR信号通路介导HEI-OC1细胞衰老目的:本部分以HEI-OC1细胞为研究对象,以H2O2诱导HEI-OC1细胞衰老,分别过表达或抑制PIN1、抑制或激活Akt信号通路,观察细胞衰老变化,明确PI3K/Akt/m TOR信号通路在HEI-OC1细胞衰老中作用,探讨PIN1下调是否通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路参与HEI-OC1细胞的衰老。方法:1.为了明确PI3K/Akt/m TOR信号通路在HEI-OC1细胞衰老中的可能作用,将细胞随机分为:Control组、H2O2组、LY294002+H2O2组、SC79+H2O2组和H2O2+DMSO组。首先以LY294002 25μM、SC79 4μg/m L或DMSO预处理细胞1 h后给予1 m M H2O2刺激,2 h后收集细胞,Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白的表达,同时收集细胞进行β-半乳糖苷酶染色。2.为了探讨PIN1是否通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路介导H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老,首先将HEI-OC1细胞分为Control组、H2O2组、H2O2+OE-PIN1组、H2O2+NC组和胡桃醌组,Western blot方法检测Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR蛋白及衰老相关蛋白的表达。结果:1.PI3K/Akt/m TOR信号通路活化参与H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老与对照组相比,H2O2组p-Akt、p-m TOR蛋白表达明显升高,而分别采用Akt信号通路的激活剂SC79或抑制剂LY294002预处理HEI-OC1细胞,再给予H2O2刺激,western blot结果显示,SC79能够显著上调p-Akt、p-m TOR蛋白表达,同时p-p53、p16、p21的表达和SA-β-gal阳性细胞的数量明显升高,而LY294002能够降低p-Akt、p-m TOR、p-p53、p16、p21的表达和SA-β-gal阳性细胞的数量。无论是Akt激活剂还是抑制剂均不影响细胞中PIN1蛋白表达。2.PIN1通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路介导H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老与H2O2组相比,上调PIN1蛋白表达能够逆转H2O2诱导的p-Akt和p-m TOR表达上调,同时衰老细胞和衰老相关蛋白表达下降。而胡桃醌能够降低HEI-OC1细胞中PIN1蛋白表达,上调p-Akt和p-m TOR的表达,HEI-OC1细胞的衰老和衰老相关蛋白表达升高。结论:过表达PIN1可以抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路的活化,从而减轻H2O2诱导的HEI-OC1细胞的衰老;抑制PIN1后激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,促进HEI-OC1细胞衰老;提示PIN1通过影响PI3K/Akt/m TOR信号通路来介导细胞衰老。第四部分ROS通过介导p53磷酸化下调PIN1的表达,进而影响毛细胞及HEI-OC1细胞衰老目的:本部分以成年C57BL/6小鼠血清、耳蜗和HEI-OC1细胞为研究对象,体外以H2O2诱导衰老,应用p53抑制剂Pifithrin-α（PFT-α）及自由基清除剂NAC处理细胞,观察PIN1表达及衰老、衰老相关蛋白表达,探讨ROS、p53与PIN1的关系,进一步探讨PIN1在毛细胞以及HEI-OC1细胞衰老中作用。方法:1.为了探讨p53活化是否影响H2O2诱导的HEI-OC1细胞衰老时PIN1蛋白表达,将常规培养的细胞随机分为:Control组、H2O2组、PFT-α（磷酸化p53的抑制剂）+H2O2组和H2O2+DMSO组。以PFT-α10μM或DMSO预处理24 h后以1 m M H2O2刺激细胞,2 h后收集细胞,Western blot方法检测PIN1、p16、p21、p53、p-p53蛋白的表达,同时收集细胞进行β-半乳糖苷酶染色。2.为进一步验证氧化应激在HEI-OC1衰老中的作用及PIN1蛋白表达的影响,使用ROS抑制剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）预处理细胞,再给予H2O2刺激,DCFH-DA探针法检测HEI-OC1细胞内ROS的含量,Western blotting方法检测检测PIN1蛋白及衰老相关蛋白的表达水平,SA-β-Gal染色检测细胞衰老情况。3.2个月C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、胡桃醌组、胡桃醌+NAC组（n=6）,给药方法:胡桃醌腹腔注射法给药,1mg/kg,每2天1次;NAC口服法给药,1.5g/kg/d;连续4周。分别进行ABR听力和相关指标的检测。结果:1.H2O2通过介导p53磷酸化下调PIN1的表达,进而影响衰老与H2O2组相比,H2O2与PFT-α共同孵育时,p-p53蛋白水平降低,但PIN1蛋白水平显着提高。此外,PFT-α预处理细胞能够降低H2O2引起的p21和p16表达上调,并且SA-β-gal阳性细胞的百分比也降低。2.H2O2通过ROS影响p53的表达和活性,进而影响衰老H2O2组细胞中ROS水平明显高于对照组,但当加入NAC后,ROS的水平几乎恢复到对照组水平,同时p-p53表达降低,PIN1的表达水平升高,而p21和p16的表达水平降低,SA-β-gal阳性细胞的百分比也降低。3.NAC处理能够改善胡桃醌引起的小鼠听力下降和耳蜗毛细胞的衰老与对照组相比,胡桃醌组在全频听阈均有所提高,但是以高频为主。但当同时给予自由基清除剂NAC治疗时,小鼠听力明显改善,听阈值下降,同时NAC治疗组小鼠的耳蜗毛细胞中β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞减少。ELISA结果显示,胡桃醌组小鼠血清中ROS升高、PIN1降低,而NAC治疗组小鼠血清ROS水平下降,PIN1的水平上调。结论:在毛细胞衰老的过程中产生了大量的ROS,过量的ROS通过促进p53磷酸化,降低PIN1的表达,从而激活衰老相关蛋白表达,促进毛细胞衰老。