枯草杆菌漆酶的结构与功能

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漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)即含铜多酚氧化酶,属于蓝色多铜氧化酶家族的一员。漆酶有特异的氧化还原电位,以空气中的氧气为电子受体,能够将酚型底物彻底的降解为二氧化碳,中间过程不需要过氧化氢,且副产物只有水,因此应用漆酶来处理工业染料废水,是目前和未来既经济有效、又环境友好的理想治理方法。漆酶作为一种高效、绿色的催化剂在环境保护、生物检测、造纸工业(生物制浆和漂白)、食品工业(食品风味改良)等领域中日益受到关注。我们从枯草芽孢杆菌中发现了一种分泌的漆酶CAR,但该野生型漆酶CAR活力较低。为了获得活性高的性质优良的细菌漆酶,本文克隆了该漆酶的基因,并在大肠杆菌中进行了异源表达,利用定点突变方法分别获得了突变体CAH、CAHEG及CAHEGF(CAH发生突变R155H,CAHEG发生突变R155H、A158E和S210G,CAHEGF发生突变R155H、A158E、S210G和I224F),对其进行了结构与功能的研究。以ABTS为底物对比分析了野生型与突变体的酶学性质和催化效应。在此基础上,通过测定氧化还原电位,并测定各种染料在最大吸收波长下吸光值的变化,又进行了突变体降解染料的研究。与野生型CAR相比,其中CAH活力提高最为明显,氧化还原电势从0.32V提高到0.42V(相对于标准氢电极),酶活力从17.1U/mg提高到220.4U/mg。突变体CAH、CAHEG、CAHEGF与野生型漆酶最适pH分别为4.0、4.0、4.0、3.0,即定点突变后,最适pH向碱偏移;同时发现,突变体在热稳定性与pH稳定性上也均优于野生型漆酶。此外,研究发现突变体对化学结构类型不同的染料的脱色效力均要高于野生型漆酶,突变体效果最为显著的是CAH对靛蓝胭脂红和结晶紫的脱色,作用3h后脱色率可分别达到74%和63%。综上所述,我们获得的突变体在漆酶活力、热稳定性、碱性环境耐受性及染料脱色效力等方面均得到提高。通过研究优异突变体对不同工业染料的脱色作用,进一步确定了漆酶结构与功能之间的联系,为漆酶的大规模生产和加速其工业化应用的进程奠定了基础。
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