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目的:Draxin(dorsal repulsive axon guidance protein),即背侧抑制性轴突导向蛋白,是新型的抑制性轴突导向因子,在胚胎中枢神经系统发育过程中起重要的调控作用。然而Draxin在胎鼠脊髓发育过程中的表达及成年期小鼠脊髓损伤后是否发挥调控作用,尚不清楚。本文以C57BL/6胎鼠、C57BL/6小鼠及Draxin敲除小鼠为研究对象,通过免疫组织化学、Western Blot、细胞培养等技术,观察:Draxin在胚胎发育过程中的表达时间及表达部位的变化;成年小鼠脊髓损伤后,Draxin的动态表达变化过程、表达Draxin的细胞类型以及与Draxin动态变化密切相关的调控因子,探讨Draxin在脊髓损伤中的作用及作用机制。方法:1.取E9.5、E10.5、E11.5、E12.5、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5发育时期的胎鼠,做胎鼠脊髓组织的连续冠状切片,通过免疫组织化学染色方法,观察不同发育时期胎鼠脊髓内Draxin的表达及表达变化特点。2.取E9.5发育时期的胎鼠脊髓离散细胞体外培养,通过免疫组织化学染色方法,进行Draxin与Tuj-1、Nestin和GFAP等特异性标记物的双染,进一步探讨胎鼠脊髓发育时期,分泌Draxin的细胞类型。3.制备Draxin基因敲除小鼠,应用PCR和免疫组织化学染色方法,检测Draxin基因敲除小鼠敲除效率。4.2月龄野生型C57BL/6小鼠行脊髓胸10节段的半夹模型。取脊髓夹伤术后1-10天、14、21、28、42、49、56天等不同时间点,损伤部位脊髓组织,通过Western Blot检测Draxin、LRP6、Wnt5a、RhoA的表达变化情况。5.2月龄野生型C57BL/6小鼠,取脊髓半夹术后4天损伤部位脊髓组织,行连续冠状切片,通过免疫组织化学染色方法,分别用Draxin与BLBP、GFAP和Nestin进行免疫双染,进一步探讨脊髓损伤后分泌Draxin的细胞类型。6.2月龄野生型C57BL/6小鼠,取脊髓半夹术后4天损伤部位脊髓组织,行连续冠状切片,通过免疫组织化学染色方法,分别用Draxin与LRP6、Fzd3、Wnt5a和RhoA进行免疫双染,探讨Draxin在脊髓损伤后发挥调控作用的相关因子。7.2月龄野生型C57BL/6小鼠假手术组、野生型小鼠(WT)手术组、基因敲除小鼠(KO)手术组,取脊髓半夹术后4天损伤部位脊髓组织,应用Western Blot方法,检测LRP6、Fzd3、Wnt5a、RhoA的表达变化与Draxin表达之间的相关性。结果:1.免疫组织化学染色结果显示,不同发育时期胎鼠脊髓内部及其周边组织内,Draxin的表达呈现明显的动态变化趋势。2.体外培养结合免疫组化双染的结果显示,部分Tuj-1阳性的未成熟神经元、Nestin阳性的神经干细胞以及GFAP阳性的星形胶质细胞,均表达Draxin。3.PCR结果显示,野生型小鼠的PCR产物为634bp片段,Draxin基因敲除型小鼠的PCR产物为336bp片段。免疫组织化学染色方法结果显示,野生型小鼠损伤脊髓组织区域内Draxin表达明显,而Draxin基因敲除型小鼠脊髓损伤处无明显阳性信号。4.野生型小鼠脊髓损伤后不同时间点,Western Blot检测结果显示,Draxin蛋白出现不同的动态表达增高,且LRP6、Wnt5a和RhoA也在脊髓损伤后出现类似的表达增高变化趋势。5.野生型小鼠脊髓损伤后4天,免疫组化双染结果显示,部分BLBP、GFAP阳性的胶质细胞及部分Nestin阳性的神经干细胞,均表达Draxin。6.野生型小鼠脊髓损伤后4天,免疫组化双染结果显示,部分LRP6阳性细胞、部分Fzd3阳性细胞、部分Wnt5a阳性细胞和部分RhoA阳性细胞,均表达Draxin。7.不同手术组术后4天,Western Blot检测结果显示,与WT假手术组相比:WT手术组Draxin表达显著增加,KO手术组未见明显的Draxin蛋白表达;WT手术组LPR6蛋白表达明显增加,Draxin敲除后LRP6蛋白增加幅度降低;WT手术组Fzd3、Wnt5a及RhoA等蛋白表达明显增加,Draxin敲除后Fzd3、Wnt5a及RhoA等蛋白增加幅度显著降低(n=8,P<0.05)。结论:1.胎鼠脊髓发育过程中,Draxin的表达具有明显的动态变化趋势,多种类型的神经元和星形胶质细胞分泌Draxin。2.脊髓损伤后,损伤区域内及周边基底膜Draxin表达明显。Draxin具有明显的动态变化趋势,多种类型的神经元和胶质细胞分泌Draxin。3.脊髓损伤后再次表达增高的Draxin,可能通过Wnt信号通路、Rho族GTP酶信号通路发挥调控作用。