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目的:湿热致病往往表现为大便粘滞不爽、臭秽,身热不扬,病程缠绵难愈等。本研究拟通过观察湿热对肠道微生态、肠道黏膜免疫及其调控的信号通路等的影响,探讨湿热致病的病理机制。方法:使用人工气候箱模拟正常和湿热两种环境,采用20%半数致死量FM1流感病毒鼠肺适应株建立正常环境和湿热环境流感小鼠模型。1、观察小鼠的一般情况、生存率,并通过血凝实验、反转录酶-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和苏木精-伊红(hematoxylin and eosin、H&E)染色观察小鼠造模是否成功及其肺部的微观结构和病理损伤情况。2、使用16S rDNA测序技术,检测不同饲养环境下小鼠肠道菌谱1000余种微生物的变化,并检测小鼠肠黏膜通透性相关蛋白及短链脂肪酸受体的信使核糖核酸(Messenger RNA,mRNA)的表达,阐明湿热致病排泄物黏滞的特点。3、采用RT-PCR检测小鼠体内核苷酸结合寡聚域样受体(NOD-like receptors,NLRs)免疫识别通路相关关键结点的基因的表达,如NOD1、NOD2、RIP2、NF-kB阐明湿热对机体免疫识别的影响;4、检测B细胞相关的肠道黏膜免疫系统多聚免疫球蛋白受体pIgR(polymeric immunoglobulin receptor)及分泌型免疫球蛋白A(secretory IgA,SIgA)、IgA等的变化,阐明湿热对天然免疫的影响。5、比较正常和湿热环境中流感小鼠体内辅助性T淋巴细胞亚群改变,采用流式细胞术检测小鼠辅助性T细胞(Helper T cell,Th)亚群中的Th1/Th2和Th17/Treg细胞比例,采用Luminex MagPix悬液芯片检测T细胞相关细胞因子的变化和炎症因子的变化,阐明湿热对机体免疫平衡的影响及其所导致的缠绵难愈的病理机制;6、通过使用祛湿热药物葛根芩连汤治疗湿热环境下流感病毒感染小鼠,并结合菌群移植实验,反向验证湿热致病的本质是通过改变肠道微生态从而下调肠道黏膜免疫的这一假说。结果:1.湿热环境下流感小鼠一般情况变化的观察:正常环境中饲养的小鼠的活动度无明显变化。体重无减低,且缓慢增长,被毛顺滑,大便便质颜色正常,无异常异味。湿热环境小鼠体重增长缓慢,活动度、饮食和饮水减少,小鼠喜欢身体蜷缩,被毛不平整,肛门脱垂,反应较为迟钝,目光呆滞,大便变稀,气味较臭。流感病毒滴鼻造模感染后,病毒感染模型组小鼠蜷缩抱团、无精打采、被毛竖起不光滑,少量小鼠感染后死亡;在湿热环境中饲养的小鼠情况与病毒模型对照组比较,偶尔打喷嚏、身体蜷缩,抱团,肛门脱垂,目光呆滞,大便气味较臭。2.湿热环境对流感小鼠肠道微生态的影响:在湿热环境中饲养的小鼠肠道菌群发生改变,湿热环境下小鼠肠道菌群操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTU)数更少,OTU的分布差异也较多。通过Beta多样性分析的分析,我们采用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和非线性多维标度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)发现正常环境和湿热环境小鼠肠道菌群的组成有显著差异。并且多变量统计学方法主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)分析也显示正常环境和湿热环境小鼠粪便中微生物进化上的相似性较小、差异性较大。肠道菌群群落结构分析和OTU及物种丰度分布热图的结果也证明了,湿热环境能够显著造成小鼠肠道菌群失衡,使其结构和组成发生改变。并且我们也找到了正常环境和湿热环境之间差异性菌群。并且我们发现,湿热环境下小鼠肠道闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白1(ZO-1)的表达下调(P<0.05)。在感染病毒后,湿热环境+病毒感染组小鼠的Occludin和ZO-1的表达下调明显(P<0.05)。相较于正常环境小鼠,湿热环境下小鼠肠道短链脂肪酸受体3(free fatty acid receptor 3,FFAR3)、短链脂肪酸受体2(free fatty acid receptor 3,FFAR2)受体的表达升高,烟酸受体(HCAR3)的表达下调(P<0.05)。3.湿热环境对流感小鼠肠道粘膜免疫的影响:湿热环境引起菌群失调后,易位入血的细菌激活了模式识别受体。导致NOD1、RIP2和核因子κB(Nuclear factor kB,NF-kB)的表达显著升高(P<0.05);sIgA、IgA表达下降。在正常环境下感染病毒后,NOD1、NOD2、RIP2、NF-kB的表达都有所升高。湿热环境下感染流感病毒后,相对于正常环境感染流感病毒,NOD1、NOD2、RIP2、NF-kB都被上调(P<0.05)。在湿热环境下,γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素1(Interleukin–1,IL-1)、白细胞介素17(Interleukin–17,IL-17)、白细胞介素6(Interleukin–6,IL-6)和白细胞介素22(Interleukin–22,IL-22)升高,IL-10下降(P<0.05)。在湿热环境+病毒感染组中,IL-2升高,IL-6、IL-10和IL-22下降(P<0.05)。4.湿热环境下流感小鼠Th1/Th2、Th17/Treg平衡及其相关细胞因子的变化:小鼠T细胞亚群及其湿热环境下小鼠Th17/Treg细胞比值相对于正常环境减少(P<0.05)。病毒感染后相对于湿热环境组来说上升(P<0.05),这可能是由于病毒感染造成小鼠炎症所导致。与正常环境组相比,湿热环境组表达量升高的有IL-2、IL-6,表达量降低的有IFN-γ和IL-10。在病毒感染后,湿热环境+病毒感染组与正常环境+病毒感染组相比较,表达升高的有IL-2,而表达降低的有IL-17A、IFN-γ、IL-10。5.清利湿热经方治疗后菌群移植验证湿热环境对肠道微生态及黏膜免疫的影响:通过清热利湿经方治疗后菌群移植,我们发现小鼠一般情况得到改善,肠道菌群丰度和多样性相对于无治疗组小鼠相比升高,而相对于湿热环境粪便移植小鼠,湿热环境+葛根芩连汤粪便移植小鼠肠道ZO-1、Occludin、Claudin-5的表达升高(P<0.05)。在感染病毒后,湿热环境+葛根芩连汤粪便移植+病毒感染小鼠Occludin、Claudin-5的表达相对于湿热环境粪便移植小鼠+病毒感染组来说升高明显(P<0.05),湿热环境+葛根芩连汤粪便移植小鼠肠道代谢产物受体FFAR3、FFAR2、HCAR3受体的表达降低(P<0.05)而通过葛根芩连汤治疗后菌群移植,NOD1、RIP2的表达降低,pIgR表达升高(P<0.05)。NOD2的表达有降低的趋势(P>0.05)。在感染病毒后,NOD1、NOD2、NF-kB和pIgR的表达都有所升高。葛根芩连汤治疗后菌群移植组Th17细胞比例减少,Treg细胞比例升高,相对于未采用葛根芩连汤治疗组小鼠具有统计学差异(P<0.05)。而Th1和Th2的变化无显著差异。在病毒感染后,Th1的比例相对于无病毒感染组小鼠升高明显(P<0.05)。葛根芩连汤治疗后菌群移植能够使小鼠Th1/Th2和Th17/Treg的比值下降(P<0.05)。感染病毒后,葛根芩连汤治疗后菌群移植组小鼠相对于无治疗组小鼠更低。而Th17/Treg的比值在病毒感染后下降,相对于湿热环境移植组小鼠,葛根芩连汤治疗后菌群移植组小鼠Th17/Treg的比值下降明显(P<0.05)。结论:1.湿热环境能影响机体肠道微生态,导致肠道菌群的组成结构、菌群丰度和多样性失衡,并可导致肠道微生物代谢产物含量发生变化,从而改变肠道菌群短链脂肪酸受体和吲哚化合物等代谢产物受体表达升高,造成肠黏膜通透性增加。这可能是湿热致病所表现出的排泄物黏滞、臭秽等症状的病理机制。2.湿热环境能影响肠粘膜免疫系统,导致pIgR、sIgA和IgA的表达降低,使机体无法清除肠道黏膜局部易位的菌群和相关的病原体。并且湿热环境导致肠道菌群失衡后,还能导致肠道中NLRs免疫识别信号通路NOD1、NOD2、NF-kB和pIgR等相关基因表达升高,导致肠道附近相关炎症因子增多,加重局部炎症,造成肠道通透性增加,从而致使感受湿热后疾病缠绵难愈,病程变长。3.湿热环境能够造成机体炎症细胞因子的表达升高,引起Th/Treg免疫失衡,抑制Th2与Treg的成熟及分化,并使IL-2、IL-6等细胞因子表达升高,而IFN-γ和IL-17A表达降低,导致辅助性T细胞介导的免疫应答受到抑制,这可能导致机体无法有效识别和抵抗外来微生物。上述的病理变化可能是湿热致病所表现的缠绵不愈,病程延长的生物学机制之一,且可以与湿热对黏膜免疫的影响相互佐证。